DE60015156T2

DE60015156T2 - Verwendung von enzymatischen austerfleischhydrolysaten zur herstellung von antiradikalischen zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60015156T2
Application number: DE60015156T
Authority: DE
Inventors: Patrick Durand; Annie Landrein; Philippe Roy; Albert Lindenbaum; Marvin Edeas
Original assignee: Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER); Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER); Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: FR2798140A1; US7270807B2; US6841171B1; WO2001017538A1; AU7296500A; DE60015156D1; EP1207892B1; FR2798140B1; ATE279931T1; US20050074423A1; EP1207892A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von enzymatischen Hydrolysaten aus Austernfleisch zur Herstellung von Verbindungen gegen freie Radikale, die insbesondere bei der Krankenbehandlung, im Ernährungsbereich und der Schönheits- und Körperpflege von Nutzen sind.
Freie Sauerstoffradikale sind Atome oder Moleküle, die ein ungepaartes Elektron auf dem äußeren Orbital aufweisen, (OH^–, O₂ ^–, ROO^–, RO^–, ....). Daher sind sie äußerst instabil und können mit stabilen Molekülen wie Lipiden, Kohlenhydraten, Eiweißen oder Nukleinsäuren reagieren, die grundlegende Elemente der Zellen sind, um das fehlende Elektron wieder aufzunehmen, wobei diese Reaktion zur Kettenbildung weiterer freier Radikale führt. Außerdem sind sie in der Lage, schwerwiegende Zellveränderungen hervorzurufen wie eine Zellmutation oder Zellalterung, ja sogar den Tod von Zellen.
Auf Zellebene bilden sich ständig freie Sauerstoffradikale. Sie können sich auch im Verlauf von Entgiftungsvorgängen nach Einfluss von bestimmten Substanzen oder unter der Einwirkung von Strahlung bilden. In der Regel wird die endogene Erzeugung von freien Sauerstoffradikalen ausgeglichen durch Verteidigungseinrichtungen, die einerseits durch Enzyme (Superoxiddismutasen, Katalasen, Glutathionperoxidasen) verkörpert werden, die die wirksamen Formen des Sauerstoffs abfangen, und andererseits durch „Radikalfänger" (Glutathion, Harnsäure, Vitamin C, Vitamin A, Vitamin E, Taurin, ...), die die Kettenperoxidationen von Membranlipiden hemmen, sodass die Lebewesen dadurch nicht zu Schaden kommen.
Jedoch können viele Umstände zu einer übermäßigen Bildung von freien Sauerstoffradikalen führen: starke Sonnenbestrahlung, Vergiftung durch bestimmte chemische Erzeugnisse und bestimmte Arzneimittel, übermäßige oder erneute starke Sauerstoffanreicherung in Geweben, denen vorher Sauerstoff entzogen wurde, das Auftreten einer starken (Verbrennungen, Ansteckungen, ...) oder chronischen entzündlichen Reaktion. Ein Überschuss an freien Sauerstoffradikalen kann auch mit einer Erbkrankheit oder einer Herabsetzung der Abwehrkräfte zusammenhängen: nicht voll entwickelte enzymatische Systeme bei Neugeborenen, das Altwerden, ein Mangel an Vitaminen und Spurenelementen (Selen, Zink, ...) in der Nahrung.
Jedenfalls wird dem Ungleichgewicht zwischen der Erzeugung und der Zerstörung von freien Sauerstoffradikalen eine Rolle bei der Entstehung und dem Bestehen einer Anzahl von chronischen Erkrankungen wie Arteriosklerose, bösartigen Erkrankungen, Entzündungskrankheiten (zum Beispiel Crohnsche Krankheit) und Nervendegenerationskrankheiten (Alzheimer-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, ...) zugeschrieben, oder beim Altern, sowie bei akuten Erkrankungen wie postischämischen Reperfusionsschäden, Verbrennungen, septischen Schocks, Virusinfektionen, schweren Ansteckungserkrankungen und Allergien, ohne dass es immer möglich ist, genau anzugeben, ob die freien Radikale die Ursache oder die Folge der Krankheit sind, oder beides gleichzeitig. Es wird damit verständlich, dass sehr viele Arbeiten zur Zeit darauf abzielen, die Rolle der freien Sauerstoffradikale in der Pathophysiologie besser zu erfassen und geeignete Zusammensetzungen oder Verbindungen zu entwickeln, die den schädlichen Auswirkungen der freien Radikale entgegenwirken.
Verfasser (LIVINGSTONE et al., 1990, Funct. Ecol., 4, 415-424; REGOLI und PPINCIPATO, 1995, Aquat. Tox., 31, 143–164) haben bei Weichtieren des Meeres nicht nur das Vorhandensein von Superoxiddismutasen, Katalasen und Glutathionperoxidasen herausgestellt, sondern auch das Vorhandensein von bestimmten oxidationshemmenden Enzymen wie der Glyoxalase, die die Entgiftung von Ketonaldehyden katalysiert, die während oxidativer Belastung gebildet werden, und von Glutathiontransferasen, die eine große Bandbreite von Konjugationsreaktionen von Glutathion mit xenobiotischen Zusammensetzungen katalysieren, was eine Fähigkeit dieser Lebewesen zeigt, sich gegen freie Sauerstoffradikale zu schützen. Darüber hinaus wurden Antioxidanzien wie Glutathion, Vitamin A, Vitamin E und Taurin bei Weichtieren des Meeres entdeckt und standen in einigen Fällen mengenmäßig im Verhältnis zu der von den Tieren erfahrenen oxidativen Belastung.
Es wurde außerdem deutlich, dass die Weichtiere des Meeres Ursprung für Zusammensetzungen sein zu können, die gegen freie Radikale wirken und bei der Vorbeugung und Behandlung der schädlichen Auswirkungen freier Sauerstoffradikale verwendet werden können.
Einige Verfasser haben sich stärker für die Fähigkeit von Austernauszügen interessiert, gegen freie Radikale zu wirken. Insbesondere:

– TAPIERO und TEW {Biomed. & Pharmacother., 1996, 50, 149–153) haben die Auswirkungen eines Lyophilisats aus Austern mit der Bezeichnung JCOE (JAPAN CLINIC Oyster Extract) bei einer HL60-Zellkultur auf den Gehalt an Glutathion stimulierendem Hormon (GSH) in der Zelle untersucht sowie auf die Wirkung der Glutathion-S-Transferase (GST). Dieses Lyophilisat wird durch Erhitzung des Austernfleischs für 1 Stunde auf 80°C gewonnen, wonach das entstehende Erzeugnis zentrifugiert und der so gewonnene Überstand gefriergetrocknet wird. TAPIERO und TEW haben damit einen erheblichen Anstieg der Synthese von GSH bei den in Anwesenheit des Lyophilisats gezüchteten HL60-Zellen festgestellt, ohne jedoch eine bedeutende Veränderung der Wirkung des GST festzustellen.
– YOSHIKAWA et al. (Biomed. & Pharmacother., 1997, 51, 328–332) haben gezeigt, dass ein JCOE-Austernlyophilisat in vitro in der Lage ist, Superoxid- und Hydroxylradikale zu fangen und die Zellen der Magenschleimhaut von Ratten gegen die schädlichen Auswirkungen von Wasserstoffperoxid zu schützen, wenn diese Zellen für 24 Stunden mit diesem Lyophilisat vorbehandelt werden.
– KIMURA et al. {Journal of Ethnopharmacology, 1998, 59, 117–123) haben gezeigt, dass Ratten, die mit peroxidiertem Maisöl gefüttert werden und zweimal pro Tag auf oralem Weg einen wässrigen Austernauszug erhalten, niedrigere Anteile an freien Fettsäuren, Triglyzeriden und Lipidperoxiden im Serum sowie einen niedrigeren Anteil an Gesamtcholesterin in der Leber aufweisen als die Anteile, die bei Ratten beobachtet wurden, die auf die gleiche Art gefüttert wurden, jedoch keinen wässrigen Austernauszug erhielten. Darüber hinaus haben die Verfasser das Vorhandensein eines Stoffs in diesem wässrigen Austernauszug herausgestellt, der in der Lage ist, gleichzeitig die Fettspaltung zu hemmen, die durch Adrenalin herbeigeführt wird, und die Fettbildung auf aus Glucose in den Fettzellen von Ratten anzuregen, und die sie als Adenosin identifiziert haben.
– NOMURA et al. haben in der europäischen Patentanmeldung, die unter der Nr. 0 806 465 im Namen von JAPAN CLINIC Co. Ltd. veröffentlicht ist, die Herstellung einer oxidationshemmenden Verbindung durch ein Verfahren vorgeschlagen, das darin besteht, einen wässrigen Austernauszug mit Ethanol zu fraktionieren, der durch Erhitzen eines Gemischs aus Austernfleisch und Wasser bei einer Temperatur zwischen 50 und 90 °C für 2 bis 3 Stunden gewonnen wurde. Die oxidationshemmenden Eigenschaften der so hergestellten Verbindung werden in dieser Patentanmeldung durch Versuche herausgestellt, mit denen ihre Fähigkeit beurteilt werden soll, die Reaktion zwischen Superoxidanionen, die von einem Xanthin-Xanthinoxodase-Enzymsystem erzeugt werden, und 5,5-Dimethyl-1-Pyrrolen-1-Oxid in vitro zu hemmen.
– DUSSRRT (IFREMER-Bericht: Stage de VIème Année, 1997, Fakultät für Pharmazie, Universität Lille II) hat eine Untersuchung zum Vergleich der Eigenschaften hinsichtlich der Wirkung gegen freie Radikale von wässrigen Austernauszügen durchgeführt, die durch Mischen einer zerkleinerten Masse Austernfleisch mit entsalztem Wasser hergestellt sind, wobei die entstehende Mischung anschließend zentrifugiert und der Überstand gefriergetrocknet wird, mit den Eigenschaften von Austernauszügen, die durch ausschließliche Gefriertrocknung einer zerkleinerten Austernmasse hergestellt wird. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass, wenn die beiden Arten von Austernauszügen in vitro eine schützende Wirkung auf rote Blutkörperchen gegen die Oxidation aufweisen, die einerseits durch einen Stoff verursacht wird, der Peroxidradikale erzeugt, und andererseits auf Lipoproteine geringer Dichte (LDL) gegen die Oxidation durch Kupfer, die wässrigen Austernauszüge das vorteilhafteste oxidationshemmende Potenzial aufzuwei sen scheinen.

In den japanischen Patentanmeldungen, die unter den Nummern 7-082132 und 7-102252 veröffentlicht wurden, wird darüber hinaus die Verwendung von Hydrolysaten, die aus dem Schleim von Austern hergestellt sind, als geeignete Antioxidationsmittel in Verbindungen für kosmetische Zwecke vorgeschlagen, die der Hautalterung und insbesondere der Faltenbildung vorbeugen. Diese Hydrolysate werden gewonnen, indem Austern zentrifugiert oder ausgepresst werden, nachdem sie aus ihren Schalen entfernt und das Fleisch entfernt wurde. Mit dem Schleim erfolgen dann eine Reihe von Fraktionierungen mit Ethanol, um ihn vom Natriumchlorid zu befreien, das er enthält, und anschließend eine Eiweißspaltung. In der japanischen Patentanmeldung Nr. 7-102252 wird mit dem Schleim, sobald er hydrolysiert ist, ein zusätzlicher Entsalzungsvorgang vorgenommen, wiederum mithilfe von Ethanol, um seine Färbung abzuschwächen.
Die Herstellungskosten solcher Hydrolysate sind sehr hoch, insbesondere aufgrund der nicht unerheblichen Mengen Ethanol, die bei den Entsalzungsvorgängen eingesetzt werden, und aufgrund der Notwendigkeit, besondere und recht teure Einrichtungen einzusetzen, die durch die Verwendung organischer Lösemittel benötigt werden. Dadurch ist es, unabhängig davon, ob sie eine bedeutende Wirksamkeit gegen freie Radikale aufweisen, nicht wünschenswert, diese Art von Hydrolysaten für die Herstellung von Verbindungen gegen freie Radikale im gewerblichen Maßstab zu verwenden, insbesondere wenn sie als Nahrungsergänzungsmittel vermarktet werden sollen.
Im Rahmen ihrer Arbeiten haben die Erfinder festgestellt, dass Hydrolysate aus Austern, die dadurch gewonnen werden, dass Austernfleisch unter geeigneten Bedingungen dem Einfluss einer Protease ausgesetzt wird, überraschenderweise eine noch höhere Wirksamkeit gegen freie Radikale aufweisen als die, die bei den wässrigen Austernauszügen beobachtet wurde, die von DUSSART in der zuvor erwähnten Untersuchung getestet wurden, und daher in der Lage sind, vorteilhaft für die Herstellung von Verbindungen genutzt zu werden, die den schädlichen Auswirkungen freier Sauerstoffradikale vorbeugen oder sie behandeln sollen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Verwendung eines enzymatischen Hydrolysats aus Austern zur Herstellung einer Verbindung für pharmazeutische Zwecke, die gegen freie Radikale wirkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch Hydrolyse von Austernfleisch mit Hilfe einer Protease gewonnen wird, nach einem Verfahren, für das keine organischen Lösemittel verwendet werden.
Gemäß einer ersten vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Hydrolyse des Austernfleischs mit einer Protease, die unter Subtilisin, Pepsin und Trypsin ausgewählt wird. Denn abgesehen davon, dass diese Proteasen mit der gewerblichen Nutzung der Erfindung zu vereinbarende Kosten aufweisen, weisen sie den Vorteil auf, zu den Enzymen zu gehören, deren Verwendung für die Herstellung von Eiweißhydrolysaten, die in die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln eingehen, in sehr vielen Ländern erlaubt ist.
Insofern als nicht alle Proteasen in denselben pH-Wert- und Temperaturbereichen wirksam sind, hängen die pH-Wert- und Temperaturbedingungen, unter denen die Hydrolyse des Austernfleischs erfolgt, von der Protease ab, die zum Durchführen der Hydrolyse ausgewählt wird.
Vorzugsweise sind die pH-Wert- und Temperaturbedingungen so gestaltet, dass durch sie eine bestmögliche Wirksamkeit der Protease erreicht wird. So wird zum Beispiel die Hydrolyse im Fall von Subtilisin vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 8 und einer Temperatur von etwa 60 °C durchgeführt, im Fall von Pepsin bei einem pH-Wert von etwa 2 und einer Temperatur von etwa 40 °C und im Fall von Trypsin bei einem pH-Wert von etwa 8 und einer Temperatur von etwa 37 °C.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Hydrolyse des Austernfleischs ausreichend lange ausgeführt, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 30 % und vorzugsweise 50% aufweist, wobei der Hydrolysegrad der Eiweiße nach folgender Formel bestimmt wird (ADLER-NISSEN, 1977, Proc. Biochem., 12, 18–23): HG = (h/h gesamt) × 100wobei:

– h gesamt die Gesamtzahl der Peptidbindungen im Austernfleisch zu Beginn der Hydrolyse ist, während
– h die Anzahl der während der Hydrolyse hydrolysierten Peptidbindungen ist und bestimmt wird durch den Unterschied zwischen der Zahl der freien Aminoenden (oder Karboxylenden) im Hydrolysat am Ende der Hydrolyse (h₁) und der Zahl der freien Aminoenden (oder Karboxylenden) in der zerkleinerten Masse zu Beginn der Hydrolyse (h₀).

Im Sinne der vorliegenden Erfindung entspricht der Beginn der Hydrolyse dem Augenblick, in dem die Protease in Berührung mit dem Austernfleisch gebracht wird, während ihr Ende dem Augenblick entspricht, in dem die Hydrolyse durch Inaktivierung der Protease beendet wird, zum Beispiel durch Hitzedenaturierung oder Veränderung des pH-Werts.
Die Gesamtzahl der Peptidbindungen (h gesamt) im Austernfleisch kann aus dem Unterschied zwischen der Menge an Gesamtaminosäuren (frei und gebunden) und der Menge an freien Aminosäuren gewonnen werden, die das Fleisch enthält. Die Menge an Gesamtaminosäuren und die Menge an freien Aminosäuren können zum Beispiel mithilfe einer Ausrüstung wie der bestimmt werden, die von dem Unternehmen WATERS unter der Bezeichnung WATERS AccQ-Tag Chemistry Package^® vermarktet wird. Die Anzahl der während der Hydrolyse hydrolysierten Peptidbindungen (h) wird aus dem Unterschied zwischen der Menge der freien Aminoenden (h₁) im Hydrolysat am Ende der Hydrolyse und der Menge der freien Aminoenden (h₀) im Austernfleisch zu Beginn der Hydrolyse gewonnen, die zum Beispiel durch Reaktion mit Fluordinitrobenzol gemäß dem Protokoll bestimmt werden können, das in Biochem. J., 45, 563, 1949 beschrieben ist.
Auch hier hängt die Zeit, die die Hydrolyse dauern sollte, damit ein Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 30% und vorzugsweise 50% aufweist, von der Protease ab, die zum Durchführen der Hydrolyse ausgewählt wird, und bei der gleichen Protease von den pH-Wert-Bedingungen und den Temperaturbedingungen, unter denen die Hydrolyse durchgeführt wird sowie von der Menge, in der diese Protease verwendet wird, da die Hydrolyse umso schneller abläuft, je größer die Menge der Protease ist.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Hydrolysat dazu geeignet, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das vor der Hydrolyse das Abtropfen des Austernfleischs beinhaltet. Erfindungsgemäß kann dieser Vorgang durchgeführt werden, indem die Austern, sobald sie aus ihren Schalen entfernt sind, in einem Abtropfgestell ruhen gelassen werden, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 4 und 8 °C, um jeder Veränderung des Fleischs vorzubeugen, solange, bis keine Flüssigkeit mehr von dem Abtropfgestell abläuft.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Hydrolysat dazu geeignet, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das vor der Hydrolyse die Zerkleinerung des Austernfleischs beinhaltet, bevor die entstehende zerkleinerte Masse gegebenenfalls in Wasser verdünnt wird.
Besonders bevorzugt wird die Zerkleinerung nach dem Abtropfen des Austernfleischs ausgeführt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Hydrolyse durch Hitzedenaturierung der Protease beendet.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Hydrolysat dazu geeignet, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das zusätzlich die Gewinnung der flüssigen Phase des Hydrolysats umfasst, wie es am Ende der Hydrolyse vorliegt. Die Gewinnung, mit der die verschiedenen Überreste (Überreste der Schalen, Membranreste, ...) entfernt werden sollen, die im Hydrolysat sein könnten, kann mit allen herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, die zur Trennung einer flüssigen Phase von einer festen Phase verwendet werden, zum Beispiel Zentrifugieren, Ultrazentrifugieren, Filtrieren, Mikrofiltrieren, wobei diese Verfahren vorteilhaft miteinander verknüpft werden können.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Hydrolysat dazu geeignet, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das folgende Schritte umfasst:

a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs,
b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v),
c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Subtilisin, bei einem pH-Wert von ungefähr 8 und bei einer Temperatur von ungefähr 60 °C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50 % aufweist,
d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Subtilisins, und
e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Hydrolysat dazu geeignet, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das folgende Schritte umfasst:

a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs,
b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v),
c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Pepsin, bei einem pH-Wert von ungefähr 2 und bei einer Temperatur von ungefähr 40 °C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50 % aufweist,
d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Pepsins, und
e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.

a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs,
b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v),
c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Trypsin, bei einem pH-Wert von ungefähr 8 und bei einer Temperatur von ungefähr 37 °C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50 % aufweist,
d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Trypsins, und
e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.

Derartige enzymatische Hydrolysate aus Austern weisen Eigenschaften gegen freie Radikale auf, die nicht nur ausgeprägt sind, sondern auch außerordentlich vorteilhaft sind, da sie sich nicht nur dazu in der Lage erweisen, die Auswirkungen freier Sauerstoffradikale aufzuheben, die im Verlauf von Peroxidationsreaktionen gebildet werden, sondern auch dazu, die Bildung dieser freien Radikale dadurch zu verhindern, was ein Vorgang der Chelatbildung bei Metallen wie Kupfer zu sein scheint, die bei der Entstehung der freien Radikale beteiligt sind.
Außerdem weisen sie den Vorteil auf, durch ein Verfahren gewonnen werden zu können, das einfach durchzuführen und in wirtschaftlicher Hinsicht vereinbar mit industriellen Erfordernissen ist, insbesondere weil kein organisches Lösemittel verwendet werden muss.
Diese Hydrolysate können daher vorteilhaft verwendet werden für die Herstellung:

– von Verbindungen für pharmazeutische Zwecke, die Erkrankungen behandeln sollen, die mit einem Ungleichgewicht zwischen der Erzeugung und Zerstörung freier Sauerstoffradikale verbunden zu sein scheinen, wie zuvor erwähnt,
– von geeigneten Nahrungsergänzungsmitteln, die entweder als unterstützende Mittel bei einer medizinischen Behandlung oder vorbeugend verwendet werden sollen, insbesondere für Personen, bei denen es wünschenswert ist, die natürlichen Abwehrmechanismen gegen freie Sauerstoffradikale zu stärken, weil diese Abwehrmittel physiologisch vermindert sind (ältere Menschen, Personen, deren Nahrung zu wenig Vitamine und Spurenelemente enthält, ...) oder weil sich diese Personen in Situationen befinden, die die übermäßige Bildung freier Sauerstoffradikale fördern (starke Sonnenbestrahlung, Einfluss von chemischen Erzeugnissen, ...), wobei die Protease unter Pepsin, Subtilisin und Trypsin ausgewählt wird, oder auch
– von Verbindungen für kosmetische Zwecke, die der Hautalterung vorbeugen oder sie behandeln sollen, deren Ursprung zum großen Teil im Zusammenhang mit freien Sauerstoffradikalen steht, die durch ultraviolette Strahlung im Bereich der Haut erzeugt werden.

Hierfür können sie entweder als solche verwendet werden, das heißt in wässriger Form oder gegebenenfalls in Form von trockenen Pulvern, die zum Beispiel durch Gefriertrocknung gewonnen werden, oder gemischt mit physiologisch annehmbaren Trägerstoffen und/oder anderen wirksamen Stoffen und insbesondere mit Stoffen, die ebenfalls von sich aus Eigenschaften gegen freie Radikale aufweisen, und die in der Lage sind, in größeren Zusammensetzungen synergistisch zu wirken (zum Beispiel die Vitamine A, C oder E).
Abgesehen von den vorstehenden Ausgestaltungen umfasst die Erfindung noch weitere Ausgestaltungen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, die Beispiele betrifft, die die hydrolytische Wirksamkeit von Enzymen auf zerkleinerte Massen Austernfleisch, die Herstellung enzymatischer Hydrolysate aus Austernfleisch sowie die biologischen Eigenschaften dieser Hydrolysate veranschaulichen, und die sich auf die zugehörigen Zeichnungen bezieht, auf denen:
1 die Kinetik von zwei Hydrolysen darstellt, die an zerkleinerten Massen Austernfleisch mit zwei verschiedenen Mengen Subtilisin durchgeführt werden, während
2 die Kinetik einer Hydrolyse darstellt, die an einer zerkleinerten Masse Austernfleisch mit Pepsin durchgeführt wird.
Es versteht sich jedoch von selbst, dass diese Beispiele nur der Veranschaulichung der Aufgabe der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1: Untersuchung der hydrolytischen Wirksamkeit von Subtilisin auf zerkleinerte Massen Austernfleisch
Lebende Austern Crassostrea gigas, die aus der IFREMER-Muschelzucht- und Versuchseinrichtung in Bouin (Vendee, Frankreich) stammen, tropfen 1 Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4 und 8 °C auf einem metallischen Sieb ab, nachdem sie aus ihren Schalen entfernt wurden, und werden dann für 2 Minuten bei 1000 U/min mithilfe eines Ultra-Turrax^® (mit einer Höchstleistung von 170 W bei 1000 U/min) zerkleinert.
Die gewonnene zerkleinerte Masse wird in einen Reaktionsapparat gegeben, gegebenenfalls nach Aufbewahrung bei einer Temperatur von –20 °C und in diesem Fall notwendigem Auftauen. Unter Rühren werden 60 % (v/m) entsalztes Wasser hinzugegeben. Anschließend wird, weiterhin unter Rühren, eine Menge von 14 UA (wirksame Einheiten) oder 38 UA Subtilisin (erhältlich unter dem Namen Alcalase^® 2.4L von dem Unternehmen NOVO NORDISK) je kg des Gemischs, das er enthält, in den Reaktionsapparat gegeben. Die Temperatur des Reaktionsapparats wird während der gesamten Dauer der Hydrolyse auf 60 °C gehalten, also während 4 Stunden. Es wird ebenfalls die ganze Zeit gerührt und der pH-Wert wird mithilfe eines pH-Stat so geregelt, dass er ständig bei einem Wert von 8 liegt.
Am Ende der vierstündigen Hydrolyse wird die Wirkung des Subtilisin durch Hitzedenaturierung beendet, indem das Reaktionsgemisch für 25 Minuten in ein Wasserbad bei 90 °C kommt.
Mithilfe einer Quetschschlauchpumpe werden Proben aus dem Reaktionsapparat entnommen, kurz bevor Subtilisin hinzugegeben wird (t₀), dann 15 und 30 Minuten nach der Zugabe des Enzyms in den Reaktionsapparat (das heißt bei t₁₅ und t₃₀), anschließend aller 30 Minuten bis zur Beendigung der Hydrolyse (also bei t₆₀, t₉₀, t₁₂₀, t₁₅₀, t₁₈₀, t₂₁₀ und t₂₄₀). Die Proben, die Subtilisin enthalten, werden für 25 Minuten bei 90 °C in ein Wasserbad gegeben, um dessen Wirkung zu beenden. Anschließend werden alle Proben bei 13.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände werden über eine 0,7 μm Membran gefiltert, anschließend über eine 0,16 μm Membran.
Die hydrolytische Wirksamkeit von Subtilisin wird folgendermaßen bewertet:

– einerseits durch die Entwicklung des Gehalts der zerkleinerten Massen an freien Aminoenden zwischen t₁₅ und t₂₄₀, indem die Enden durch Reaktion mit Fluordinitrobenzol mengenmäßig bestimmt werden, wobei dadurch die Kinetik der Hydrolyse bestimmt werden kann, und
– andererseits durch die Entwicklung des Hydrolysegrads der Eiweiße (HG) der zerkleinerten Massen zwischen t₁₅ und t₂₄₀, wobei der Hydrolysegrad der Eiweiße nach der Formel HG = (h/h gesamt) × 100 berechnet wird, wobei h gesamt durch mengenmäßige Bestimmung der gesamten und freien Aminosäuren in den zerkleinerten Massen mithilfe einer WATERS AccQ-Tag Chemistry Package^®-Ausrüstung gewonnen wird, während h durch mengenmäßige Bestimmung der freien Aminoenden in den Proben bestimmt wird, die bei t₁₅, t₃₀, ... bis einschließlich t₂₄₀ entnommen wurden, durch Reaktion mit Fluordinitrobenzol.

1 stellt die Kinetik der Hydrolyse dar, die mit einer Menge Subtilisin von 14 UA/kg (∎) durchgeführt wird und der Hydrolyse, die mit einer Menge Subtilisin von 38 UA/kg (♦) durchgeführt wird, wobei die Werte des Gehalts an freien Aminoenden auf der Ordinate abgetragen und in mM ausgedrückt und die Zeit auf der Abszisse abgetragen und in Minuten ausgedrückt ist.
Diese Figur zeigt, dass die Hydrolyse schneller ist, wenn die Menge Subtilisin erhöht wird. Damit wird das Plateau bei einer Menge von 14 UA/kg nach 90-minütiger Hydrolyse erreicht, und diese Zeit wird bei einer Menge von 38 UA/kg auf 60 Minuten verringert. Jedoch ähnelt sich der Gehalt an freien Aminoenden, bei dem das Plateau erreicht wird, bei den beiden Enzymmengen. Das Gleiche gilt für das Endgehalt an freien Aminoenden (etwa 120 mM).
In nachstehender Tabelle I sind die Werte des Hydrolysegrads der Eiweiße (HG) dargestellt, ausgedrückt in Prozent, die bei jeder Menge Subtilisin gewonnen werden.
Tabelle I
Diese Tabelle zeigt, dass unabhängig von der verwendeten Menge Subtilisin die Geschwindigkeit der Hydrolyse abnimmt, wenn 45 % der Peptidbindungen, die potenziell hydrolysierbar sind, aufgebrochen sind. Die Hydrolyse läuft zwar weiter, jedoch schwächer, da die Endwerte des Hydrolysegrads der Eiweiße 50 % übersteigen, um in einem Fall 54 zu erreichen, in dem anderen Fall 58 %.
BEISPIEL 2: Untersuchung der hydrolytischen Wirksamkeit von Pepsin auf zerkleinerte Massen Austernfleisch
Die hydrolytische Wirksamkeit von Pepsin auf zerkleinerte Massen Austernfleisch wird unter Verwendung einer Arbeitsvorschrift bewertet, die vollkommen mit der übereinstimmt, die bei Beispiel 1 verwendet wurde, abgesehen davon, dass die Hydrolyse mit einer Menge von 1 % Masse Pepsin im Verhältnis zur Gesamtmasse des Gemischs zerkleinerte Masse/entsalztes Wasser durchgeführt wird, das im Reaktionsapparat vorliegt, bei einer Temperatur von 40 °C und bei einem pH-Wert von 2.
2 stellt die Kinetik der so gewonnenen Hydrolyse dar, wobei die Werte des Gehalts an freien Aminogruppen auf der Ordinate abgetragen sind und in mM ausgedrückt und die Zeit auf der Abszisse abgetragen und in Minuten ausgedrückt ist.
Diese Figur zeigt, dass die Hydrolyse eindeutig schneller verläuft als wenn sie mit Subtilisin durchgeführt wird, selbst bei einer Menge von 38 UA/kg, da das Plateau 30 Minuten nach Zugabe des Pepsin in den Reaktionsapparat erreicht ist. Jedoch ist der Endgehalt an freien Aminogruppen im Hydrolysat, der um etwa 120 mM liegt, völlig vergleichbar mit dem, der gewonnen wird, wenn die Hydrolyse mit Subtilisin erfolgt.
BEISPIEL 3: Herstellung enzymatischer Hydrolysate aus Austernfleisch durch Verwendung von Subtilisin
Auf der Grundlage der Ergebnisse, die durch die Untersuchung aus Beispiel 1 gewonnen wurden, werden zwei Hydrolysate hergestellt, die einen unterschiedlichen Hydrolysegrad der Eiweiße aufweisen – die im Folgenden als Hydrolysat A beziehungsweise Hydrolysat B bezeichnet sind – indem an zwei zerkleinerten, zuvor abgetropften Massen Austernfleisch eine Hydrolyse mit Subtilisin durchgeführt wird.
Die Herstellung der zerkleinerten Massen Austernfleisch und die Hydrolysen erfolgen unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei eine Menge von 38 UA je kg des Gemischs zerkleinerte Masse/entsalztes Wasser verwendet wird.
Bei Hydrolysat A wird die Hydrolyse 4 Stunden nach Zugabe des Enzyms in den Reaktionsapparat beendet, sodass es einen größtmöglichen Hydrolysegrad der Eiweiße aufweist, das heißt nahe 60 %.
Bei Hydrolysat B wird die Hydrolyse 30 Minuten nach der Zugabe des Enzyms in den Reaktionsapparat beendet, damit es einen Hydrolysegrad der Eiweiße aufweist, der im Wesentlichen der Hälfte des größtmöglichen Hydrolysegrads der Eiweiße entspricht, das heißt etwa 30 %.
In beiden Fällen wird die hydrolytische Wirksamkeit von Subtilisin dadurch beendet, dass die Reaktionsgemische für 25 Minuten in ein Wasserbad bei 90 °C kommen. Die Gemische werden anschließend bei 4000 U/min zentrifugiert. Die Überstände werden über eine 0,7 μm Membran gefiltert, anschließend über eine 0,16 μm Membran. Die so hergestellten Hydrolysate weisen ein körniges Aussehen auf und sind braungrün. Sie werden gefriergetrocknet und bei –20 °C in Flaschen gefüllt.
BEISPIEL 4: Biochemische Kennzeichnung eines enzymatischen Hydrolysats aus Austernfleisch, das erfindungsgemäß gewonnen wurde
Es wird für Hydrolysat A, das gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde, eine Untersuchung durchgeführt zur Bestimmung:

– seines Trockensubstanzgehalts,
– seines Mineralstoffgehalts,
– seines Gehalts an löslichen Eiweißen,
– seines Gehalts an Gesamtzucker und an Glykogen, sowie
– seines Gehalts an und seiner Zusammensetzung aus Gesamtaminosäuren und freien Aminosäuren,

– Mischen einer zerkleinerten Masse Austernfleisch mit entsalztem Wasser (1/3, v/v), bis ein einheitliches Gemisch entsteht, anschließend
– Zentrifugieren des entstehenden Gemischs bei 3000 g für 20 Minuten, und
– Gefriertrocknen des gesammelten Überstands am Ende des Zentrifugierens.

Der Trockensubstanzgehalt wird bestimmt, indem die Proben des Hydrolysats A solange einer Temperatur von 100 °C ausgesetzt werden, bis ein gleichbleibendes Gewicht erreicht ist (mindestens 6 Stunden) und indem der Prozentsatz berechnet wird, den dieses Gewicht im Verhältnis zum Ausgangsgewicht der Proben darstellt.
Der Mineralstoffgehalt wird bestimmt, indem die Proben des Hydrolysats A bei einer Temperatur von 600 °C für 12 Stunden verascht werden und der Prozentsatz berechnet wird, den das Gewicht des Überrests im Verhältnis zum Gewicht der Trockenmasse darstellt.
Die löslichen Eiweiße werden mengenmäßig mithilfe der Ausrüstung bestimmt, die von dem Unternehmen PIERCE unter der Handelsbezeichnung BCA^® Protein Assay Reagent vermarktet wird. Als Standardprobe wird Rinderalbumin verwendet.
Gesamtzucker und Glykogen werden mengenmäßig nach dem Verfahren bestimmt, das von M. DUBOIS et al. {Anal. Chem., 1956, 28, 350–356) beschrieben wurde. Für die mengenmäßige Bestimmung werden zuvor die Lipide gemäß dem Verfahren von E. G. BLIGHT und W. J. DYER (Can. J. Biochem. Physiol., 1959, 37, 911–917) aus den Proben entfernt.
Der Gehalt an und die Zusammensetzung aus Gesamtaminosäuren und freien Aminosäuren werden mithilfe einer WATERS AccQ-Tag Chemistry Package^®-Ausrüstung bestimmt. Für die mengenmäßige Bestimmung der Gesamtaminosäuren erfolgt für 12 Stunden bei 110 °C und im Vakuum an den Proben des Hydrolysats A zuvor eine Säurehydrolyse unter Einfluss von HCl 6N, während für die mengenmäßige Bestimmung der freien Aminosäuren den Proben des Hydrolysats A zuvor Sulfosalizylsäure zugegeben wird und sie so zentrifugiert werden, dass es zur Ausfällung der Eiweiße kommt, die in den Proben vorhanden sind.
In nachstehender Tabelle II sind der Trockensubstanzgehalt, der Mineralstoffgehalt, der Gehalt an löslichen Eiweißen, an Gesamtzucker, an Glykogen, an Gesamtaminosäuren und an freien Aminosäuren dargestellt, die im Hydrolysat A, in der zerkleinerten Austernmasse und dem wässrigen Austernauszug vorliegen.
Der Trockensubstanzgehalt ist in Prozent im Verhältnis zum gefriergetrockneten Gewicht (% p/p) der Proben ausgedrückt, außer bei der zerkleinerten Masse, wo die Trockenmasse in Prozent im Verhältnis zum Gewicht im frischen Zustand (% p/p*) der Proben ausgedrückt ist. Der Mineralstoffgehalt, der Gehalt an löslichen Eiweißen, an Gesamtzucker, an Glykogen, an Gesamtaminosäuren und an freien Aminosäuren sind in Prozent im Verhältnis zum Gewicht im trockenen Zustand (% p/p) der Proben ausgedrückt.
Tabelle II
In nachstehender Tabelle III ist die Zusammensetzung an Gesamtaminosäuren und an freien Aminosäuren im Hydrolysat A, in der zerkleinerten Austernmasse und im wässrigen Austernauszug dargestellt. Der Gehalt jeder Aminosäure ist in Prozent im Verhältnis zum Gesamtgewicht (% p/p) der Aminosäuren angegeben, die in den Proben vorliegen.
Tabelle III
Tabelle II zeigt, dass das Hydrolysat A einen Gesamtzuckergehalt aufweist, der über dem liegt, der in der zerkleinerten Masse und im wässrigen Auszug gefunden wurde. Dieser Anstieg ist zurückzuführen auf die Zersetzung der Gewebe, die durch die enzymatische Hydrolyse verursacht wird, wodurch eine stärkere Löslichmachung der Zucker möglich wird. Die Abnahme des Gehalts an löslichen Eiweißen, die zwischen der zerkleinerten Masse und dem Hydrolysat beobachtet wird, ist eine Folge der Hydrolyse nativer Eiweiße. Durch diese Hydrolyse wird eine erhebliche Menge an Peptiden und freien Aminosäuren erzeugt, die kaum mit dem Reagens reagieren, das für die mengenmäßige Bestimmung der löslichen Eiweiße verwendet wird (BCA^®). Im Gegensatz dazu verändert sich der Mineralstoffgehalt zwischen den drei Erzeugnissen nicht.
Darüber hinaus folgt aus Tabelle II, dass der Gehalt von Hydrolysat A an freien Aminosäuren wesentlich höher ist als der Gehalt des wässrigen Austernauszugs an freien Aminosäuren, wobei letzterer sehr nah bei dem liegt, der bei der zerkleinerten Masse Austernfleisch festgestellt wurde. Die höhere Menge freier Aminosäuren, die im Hydrolysat A vorliegen, ist unmittelbar mit dem Aufbrechen der Peptidbindungen verbunden, das die Hydrolysereaktion verursacht.
Unter Berücksichtigung von Tabelle III zeigt sich jedoch, dass der Anteil von freiem Taurin, das bekannterweise eine oxidationshemmende Wirkung aufweist, im Hydrolysat A niedriger ist als im wässrigen Austernauszug. So macht Taurin in freier Form im wässrigen Austernauszug 60,66 der freien Aminosäuren aus, im Vergleich zu nur 19,25 % im Hydrolysat A.
BEISPIEL 5: Biologische Wirksamkeit enzymatischer Hydrolysate aus Austernfleisch, die erfindungsgemäß gewonnen wurden
Die biologische Wirksamkeit der Hydrolysate A und B, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurden, wird durch eine Reihe von Versuchen bewertet, zur Überprüfung:

– einerseits der Fähigkeit dieser Hydrolysate, die Hämolyse zu hemmen, die durch Zugabe eines Stoffs in eine Suspension roter Blutkörperchen verursacht wird, der Peroxidradikale erzeugt, nämlich 2,2'-Azo-bis-(2- Amidinopropan)-Dihydrochlorid (AAPH), und
– andererseits der Fähigkeit dieser Hydrolysate, Lipoproteine geringer Dichte, bekannter unter der englischen Bezeichnung „Low Density Lipoproteins" (LDL), gegen eine Oxidation zu schützen, die durch Kupfer verursacht wird.

5.1 – Hemmung der Hämolyse, die durch AAPH verursacht wird:
a) Niederschrift:
5 ml menschlichen Bluts werden aus einem Röhrchen mit EDTA entnommen (das sofort in zermahlenes Eis gestellt wird) und für 10 Minuten bei 1000 g und 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wird entfernt und die roten Blutkörperchen werden dreimal mit einer NaCl-Lösung (9 %) oder mit dem Puffer PBS (pH-Wert 7,4) gewaschen. 200 μl des Bodensatzes roter Blutkörperchen werden anschließend in 9,8 μl NaCl-Lösung (9 %) oder Lösung des Puffers PBS verdünnt.
Zuerst wird die gewonnene Suspension für 10 Minuten in Berührung mit den Lösungen (NaCl 9 % oder PBS) der Hydrolysate A oder B gebracht, deren Volumen so berechnet ist, dass die Endlösung 25, 50 und 100 mg/l entspricht. Als Bezugsstoff wird eine Probe ohne Hydrolysat verwendet.
300 μl einer AAPH-Lösung, die zuvor bei 37 °C inkubiert wurde, werden dann zu den Suspensionen der roten Blutkörperchen gegeben und das Ganze wird unter vorsichtigem Rühren für 40 Minuten in ein Wasserbad gestellt.
Eine Probe der Suspension roten Blutkörperchen (ohne AAPH oder Erzeugnis) wird parallel für 1 Stunde bei –80 °C angeordnet.
Die Auflösung der roten Blutkörperchen wird durch Messung der Wirksamkeit von Laktatdehydrogenase (LDH) mithilfe eines HITACHI^® 911-Automats bewertet. Jede Messung wird doppelt ausgeführt.
Die Wirksamkeit von LDH, die für die Proben bestimmt wurde, die bei –80 °C angeordnet wurden, entspricht der Gesamthämolyse der roten Blutkörperchen.
Die Wirksamkeit von LDH, die für die Proben bestimmt wurde, die kein Hydrolysat enthalten, entspricht der Empfindlichkeit der roten Blutkörperchen gegenüber „Radikalbelastung" unter den Versuchsbedingungen. Durch diese Messung kann darüber hinaus bestätigt werden, dass die Versuchsbedingungen (Hämolyse <100 %) für die Untersuchung geeignet sind.
Für jede Hydrolysatkonzentration wird die LDH-Wirksamkeit mit der Wirksamkeit der Proben verglichen, die kein Erzeugnis enthalten und wird in Prozent der Wirksamkeit ausgedrückt.
b) Ergebnisse:
In nachstehender Tabelle IV ist der durchschnittliche Prozentsatz der Hemmung (Ia) für Lösungen mit 25, 50 und 100 mg/l Hydrolysat A und Hydrolysat B dargestellt.
Tabelle IV
Diese Tabelle zeigt, dass die enzymatischen Hydrolysate aus Austernfleisch, die erfindungsgemäß gewonnen wurden, eine deutliche Fähigkeit aufweisen, die Hämolyse zu hemmen, die durch Zugabe eines Stoffes in eine Suspension roter Blutkörperchen, der Peroxidradikale erzeugt, verursacht wurde – was bedeutet, dass sie in der Lage sind, die oxidierende Wirkung dieser Peroxidradikale aufzuheben – da die Hemmungskonzentration 50 (IC₅₀) von Hydrolysat A zwischen 25 und 50 mg/l liegt, während die von Hydrolysat B 50 mg/l beträgt.
Zum Vergleich beträgt die Hemmungskonzentration 50 (IC₅₀), die DUSSART (ebd.) für einen wässrigen Austernauszug ermittelt hat, 275 mg/l.
5.2 – Schutz der LDL gegen eine Oxidation, die durch Kupfer verursacht ist:
a) Niederschrift:
Die LDL werden aus 100 ml Plasma (EDTA-Blut) hergestellt. Zuerst werden durch Ultrazentrifugieren für 24 Stunden bei 40.000 g (Dichte: 1,019) die VLDL entfernt. Durch eine zweite Ultrazentrifugation für 24 Stunden bei 40.000 g (Dichte: 1,063) werden die LDL gewonnen. Die LDL werden dann für 24 Stunden bei 4 °C gegen den Puffer TRIS-EDTA dialysiert, in gleiche Anteile aufgeteilt und anschließend bei 4 °C aufbewahrt.
Die LDL (0,2 mg Eiweiße/ml Lösung), die vorher gegen den Puffer PBS dialysiert wurden, werden für 24 Stunden bei 37 °C in Gegenwart von Kupfer (oxidierend) und mit oder ohne die untersuchten Erzeugnisse inkubiert.
Für jede Untersuchung werden parallel 3 Gesichtspunkte untersucht:

– LDL ohne Kupfer (Bezugsstoff native LDL),
– LDL in Gegenwart von 5 μM Kupfersulfat (Bezugsstoff oxidierte LDL),
– LDL in Gegenwart von 5 μM Kupfersulfat und steigendem Anteil an Hydrolysat A und B.

Nach Beendigung der Oxidation durch BHT/EDTA wird die LDL-Lösung 24 Stunden lang bei +4 °C dialysiert und über eine 0,2 μm Membran („Millipore") gefiltert.
Die hemmende Wirkung der Hydrolysate gegenüber der Oxidation der LDL durch Kupfer wird durch die mengenmäßige Bestimmung von zwei Lipoperoxidationsmarkern mengenmäßig erfassbar:

– MDA (Malondialdehyd) für die Berechnung des Prozentsatzes der Hemmung Ib,
– Hydroperoxide für die Berechnung des Prozentsatzes der Hemmung Ic.

– Mengenmäßige Bestimmung von MDA
MDA bildet bei Wärme und in saurer Umgebung mit Thiobarbitursäure einen fluoreszierenden, Farbstoff bildenden Komplex. Nach Extraktion mit n-Butanol wird die Stärke der Fluoreszenz mithilfe eines Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der MDA-Gehalt wird mithilfe einer Staffelung von MDA von 0,2 bis 1 nmol bestimmt.
– Mengenmäßige Bestimmung der Hydroperoxide
Hydroperoxide geben Jod aus einer stabilisierten Kaliumjodidlösung frei. Das freigegebene Jod wird durch Bestimmung der optischen Dichte (D) bei 365 nm gemessen.
Der Jodgehalt der Probe wird anschließend auf Grundlage des Auslöschungskoeffizienten ε (=2,46 10⁴, 1 cm, 1 M) dieses Elements berechnet.
b) Ergebnisse:
In den nachfolgenden Tabellen V und VI ist der Prozentsatz der Hemmung (Ib) beziehungsweise (Ic) dargestellt, wie er für Lösungen mit 25, 50, 100 und 250 mg/l Hydrolysat A und Hydrolysat B gewonnen wurde.
Tabelle V
Tabelle VI
Die Tabellen zeigen, dass enzymatische Hydrolysate aus Austernfleisch, die erfindungsgemäß gewonnen werden, auch eine ausgeprägte Fähigkeit aufweisen, einer Oxidation der LDL entgegenzuwirken, die durch Kupfer verursacht wird, wobei diese Fähigkeit mit einer Chelat bildenden Wirkung gegenüber Metallen in Zusammenhang stehen könnte.

Claims

Verwendung eines enzymatischen Hydrolysats aus Austern zur Herstellung einer Verbindung für pharmazeutische Zwecke, die gegen freie Radikale wirkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch Hydrolyse von Austernfleisch mit Hilfe einer Protease gewonnen wird, nach einem Verfahren, für das keine organischen Lösemittel verwendet werden.
Verwendung eines enzymatischen Hydrolysats aus Austern zur Herstellung einer Verbindung für kosmetische Zwecke, die gegen freie Radikale wirkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch Hydrolyse von Austernfleisch mit Hilfe einer Protease gewonnen wird, nach einem Verfahren, für das keine organischen Lösemittel verwendet werden.
Verwendung eines enzymatischen Hydrolysats aus Austern zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels, das gegen freie Radikale wirkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch Hydrolyse von Austernfleisch mit Hilfe einer Protease gewonnen wird, die unter Subtilisin, Pepsin und Trypsin ausgewählt wird, nach einem Verfahren, für das keine organischen Lösemittel verwendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse mit Hilfe einer Protease ausgeführt wird, die unter Subtilisin, Pepsin und Trypsin ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse ausreichend lange ausgeführt wird, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 30% und vorzugsweise 50% aufweist, wobei der Hydrolysegrad der Eiweiße nach folgender Formel bestimmt wird: DH = (h/h gesamt) × 100wobei : – h gesamt die Gesamtzahl der Peptidbindungen im Austernfleisch zu Beginn der Hydrolyse ist, während – h die Anzahl der während der Hydrolyse hydrolysierten Peptidbindungen ist und bestimmt wird durch den Unterschied zwischen der Zahl der freien Aminoenden im Hydrolysat am Ende der Hydrolyse (h₁) und der Zahl der freien Aminoenden im Austernfleisch zu Beginn der Hydrolyse (h₀).
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat dazu geeignet ist, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das vor der Hydrolyse das Abtropfen des Austernfleischs beinhaltet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat dazu geeignet ist, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das vor der Hydrolyse die Zerkleinerung des Austernfleischs beinhaltet, bevor die entstehende zerkleinerte Masse gegebenenfalls in Wasser verdünnt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zerkleinerung nach dem Abtropfen des Austernfleischs ausgeführt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse durch Hitzedenaturierung der Protease beendet wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat dazu geeignet ist, durch ein Verfahren gewonnen zu werden, das nach der Hydrolyse die Gewinnung der flüssigen Phase des Hydrolysats umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch ein Verfahren gewonnen wird, das folgende Schritte umfasst: a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs, b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v), c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Subtilisin, bei einem pH-Wert von ungefähr 8 und bei einer Temperatur von ungefähr 60°C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50% aufweist, d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Subtilisins, und e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch ein Verfahren mit folgenden Schritten gewonnen wird: a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs, b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v), c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Pepsin, bei einem pH-Wert von ungefähr 2 und bei einer Temperatur von ungefähr 40°C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50% aufweist, d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Pepsins, und e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysat durch ein Verfahren mit folgenden Schritten gewonnen wird: a) Zerkleinern des vorher abgetropften Austernfleischs, b) Verdünnen der zerkleinerten Masse in Wasser, in einem Verhältnis zerkleinerte Masse/Wasser zwischen 30/70 und 70/30 (m/v) und vorzugsweise zwischen 40/60 und 60/40 (m/v), c) Hydrolyse der so verdünnten zerkleinerten Masse durch Trypsin, bei einem pH-Wert von ungefähr 8 und bei einer Temperatur von ungefähr 37°C, ausreichend lange, damit das Hydrolysat einen Hydrolysegrad der Eiweiße von mindestens 50% aufweist, d) Beenden der Hydrolyse durch Inaktivierung des Trypsins, und e) Gewinnen der flüssigen Phase des Hydrolysats.