DE2249165A1 - Cephalosporinverbindungen - Google Patents

Description

Dr. F. Zumsteln sen. - Dr. E. Assmann Dr. R, Koenic;' - "c ■ - Pfc!, Π., ~. Π. Holzbauer

Patente n'w Site
8 München 2, Bräuhautstraße 4/III

Cephalosporin 158
12/No

GLAXO LABORATORIES LIMITED, Middlesex, England

Cephalosporinverbindungen

Die vorliegende Erfindung betrifft Cephalosporinverbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung chromogene Cephalosporinverbindungen, die als Testreagentien auf den Gebieten der Pathologie, de"r Biochemie und der analytischen Chemie interessant sind.

Die hierin erwähnten Cephalosporinverbindungen werden im allgemeinen unter Bezugnahme auf Cepham (vgl. <I.Amer.Chem,Soc. 1962, 84, 3400) bezeichnet.

Es ist bekannt, daß der ß-Lactamring in Cephalosporinverbindungen entweder biochemisch durch ß-Lactama&en (beispielsweise durch Stämme gewisser gegen Cephalosporin resistenter^~ Bakterien erzeugt) oder chemisch, z.B. durch Basen oder Säuren, geöffnet werden kann. Es wurde nun eine Gruppe von Cephalosporinverbindungen gefunden, die' bei öffnung des ß-Lactamringes gefärbte Produkte ergeben. Diese Verbindungen sind daher zur Verwendung als empfindliche Testreagentien für Agentien geeignet, die eine öffnung des ß-Lactamrings verursachen.

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Merkmal der Erfindung ist die Schaffung einer Methode zum Test einer biologischen Probe, insbesondere einer Bakterienkultur, auf die ß-Lactamaseaktivität, die darin besteht, diese Probe in der Anwesenheit von Wasser mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

CH = CH - Ar (I)

worin R eine Aminogruppe oder eine blockierte Aminogruppe, z.B. Acylamidogruppe, ist, Ar eine aromatische Gruppe ist* die zumindest eine elektronenziehende Gruppe in Konjugation mit der exocyclischen -CH=CH-Doppelbindung trägt und X die Bedeutung von -S-, -SO- ( oi oder ß) oder -SOp- besitzt; oder einem Carboxylatderivat davon, z.B. einem Salz oder einem wasserlöslichen Ester in Kontakt zu bringen.

Allgemein interessante Salze der Verbindung I schließen Alkalimetallsalze ein, z.B. Natrium- und Kaliumsalze und Ammoniunsalze.

Als Gruppe B in Formel I kann ein weiter Bereich von blockierten Aminogruppen vorhanden sein, wobei das charakteristische Merkmal der erfindungsgemäß verwendeten Cephalosporinverbindungen in der Natur des Substituenten in der 3-Stellung liegt. So kann R beispielsweise eine Alkanoylamido- oder carbocyclische oder heterocyclische Aralkanoylamido- oder Aryloxyalkanoylamidogruppe sein. Wenn R eine Acylamidogruppe ist, so enthält sie im allgemeinen vorzugsweise 1 bis 20 Kohlenstoffatome, wobei der Acylteil beispielsweise einer der im folgenden,ohne eine Einschränkung darzustellen, dargestellten Acylgruppen entspricht.:

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(i) R^UC Hp_nCO-, worin R^u.eine Aryl- ( carbocyclisch oder heterocyclisch), Cycloalkyl-, substituierte Aryl-, substituierte Cycloalkyl-, Cycloalkadienyl- oder eine nichtaromatische oder mesoionische Gruppe ist und η eine ganze Zahl von 1-4 darstellt. Beispiele für diese Gruppe umfassen Phenylacetyl-, substituierte Phenylacetyl-, z.B. Fluorphenylacetyl-, Nitrophenylacteyl-, Aminophenylacetyl-, Acetoxyphenylacetyl-, Methoxyphenylacetyl-, Methylphenylacetyl- oder Hydroxyphenylacetylgruppen; N,N-Bis-(2-chloräthyl)-aminophenylpropionyl-; Thien-2- und -3-ylacetyl-; 4-Isoxazolyl- und substituierte 4-Isoxazolylacetyl-; Pyridylacetyl-; Furylacetyl-; Tetrazolylacetyl-; Cyclohexadienylgruppen; oder eine Sydnonacetylgruppe. Die substituierte 4-IsoxaζοIyIgruppe kann eine 3-Aryl-5-methylisoxazol-4-yl-gruppe sein, wobei die Arylgruppe z.B. eine Phenyl- oder Halogenphenyl-, z.B. Chlor- oder Bromphenylgruppe ist. Eine Acylgruppe dieser Art ist die 3-o-Chlorphenyl-5-methyl-isoxazol-4-yl-acetylgruppe. ^;

(ii) C Hp .xjCO-, worin η eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist. Die · Alkylgruppe kann gerad- oder verzweigtkettig sein und kann gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen sein oder durch z.B. eine Cyanogruppe, eine Carboxygruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Carboxycarbonylgruppe (-CO.COOH) substituiert sein. Beispiele für solche Gruppen schließen Acetyl-, Cyanoacetyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl-, Octanoyl- und Butylthioacetylgruppen ein.

(iii) C Hp _xiCO-, worin η eine ganze Zahl von 2 bis 7 ist. Die Alkenylgruppe kann gerad- oder verzweigtkettig sein und kann gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom unterbrochen sein. Ein Beispiel für eine derartige Gruppe ist die "Allylthioacetylgruppe.

(iv) R^UCC-CO- , worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung

I.

besitzt und zusätzlich eine Benzy]-Tuppe sein kann und R^ und R^w, die rlf^ch oder verschiedf-t. sein können, .jewei If' Wasser-

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BAD

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stoff, Phenyl-, Benzyl-, Phenäthyl- oder niedrig-Alkylgruppen darstellen. Beispiele für derartige Gruppen umfassen Phenoxyacetyl-, 2-Phenoxy-2-phenylacetyl-, Phenoxypropionyl-, 2-Phenoxybutyryl-, Benzyloxycarbonyl-, 2-Phenoxypropionyl-, 2-Phenoxybutyryl- und Methylthiophenoxyacetylgruppen. R^v

(v) R^US-C-CO- , worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung besitzt ^K und zusätzlich eine Benzylgruppe sein kann und R und R die unter (iv) definierten Bedeutungen besitzen. Beispiele für solche Gruppen umfassen S-Phenylthioacetyl-, S-Chlorphenylthioacetyl-, S-Fluorphenylthioacetyl-, Pyridylthioacetyl- und S-Benzylthioacetylgruppen.

(vi) R^uZ(CH₂)_mC0- , worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung besitzt und zusätzlich eine Benzylgruppe sein kann, Z ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist und m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist. Ein Beispiel für eine derartige Gruppe ist die S-Benzylthiopropionylgruppe.

(vii) R^UCO-, worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung besitzt. Beispiele für solche Gruppen umfassen Benzoyl-, substituierte Benzoyl- (z.B. Aminobenzoyl-), 4-Isoxazolyl- und substituierte 4-Isoxazolylcarbonyl-, Cyclopentancarbonyl-, Sydnoncarbonyl-, Naphthoyl- und substituierte Naphthoyl-(z.B. 2-Äthoxynaphthoyl-), Chinoxalinylcarbonyl- und substituierte Chinoxalinylcarbonylgruppen (z.B. die 3-Carboxy-2-chinoxalinylcerbonylgruppe). Andere mögliche Substituenten für Benzoyl umfassen„Alkyl-, Alkoxy-, Phenyl-, Carboxy-, Alkylamido-, Cycloalkyl amido-, Allylamido-, Phenyl-(niedrig)-alkylamido-, Mornholinocarbonyl-, Pyrrolidinocarbonyl-, Piperidinocarbonyl-, Tetrahydropyridine-,Furfurylamido- oder N-Alkyl-N-anilinogruppen oder Derivate davon und solche Substituenten können in den 2- oder 2- und 6-Stellunp;en stehen. Beispiele für solche substituierte Benzoylgruppen sind die 2,6-Dimethoxybenzoyl-, 2-Methylaraidobenzoyl- und 2-Carboxybenzoylgruppen. V/enn die Gruppe R eine substituierte 4— Isoxazolylgruppe dar-

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stellt, können die Substituenten wie vorstehend unter (i) aufgeführt sein. Beispiele für solche 4-IsoxaζοIyIgruppeη sind 3-Phenyl-5-alethyl-isoxazol-^z^~yl-carbonyl-, 3-o-Chlorphenyl^-methyl-isoxazol-^—yl-carbonyl- und 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-methyl-isoxazol-4—yl-carbonylgruppen.

(viii) R^U-GH-CO- , worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung

besitzt und Z Amino-, substituierte Aminogruppen (z.B. Acylamido- oder eine Gruppe, die durch Umsetzung der c<-Aminoacylamidogruppe der 7-Seitenkette mit einem Aldehyd oder Keton, z.B. Aceton, Methyläthylketon oder Acetessigsäureäthylester, erhalten wurde), Hydroxy-, Carboxy-, veresterte Carboxy-, Triazolyl-, Tetrazolyl-, Cyanogruppen, Halogenatome, Acyloxy-(z.B. Formyloxy- oder niedrig-Alkanoyloxy-) oder verätherte Hydroxygruppen darstellt. Beispiele für. .solche Acylgruppen sind die 2-Amino-2-phenylacetyl- und die 2-Carboxy-2-phenylacetylgrupne.

(ix) R^-C-CO- , worin E^x, R^y und R^z, die gleich oder ver-

E^z ■ . ■ ·-

schieden sein können, jeweils niedrig-Alkyl-, Phenyl- oder substituierte Phenylgruppen darstellen oder R Wasserstoff bedeutet. Ein Beispiel für eine derartige Acylgruppe ist die Triphenylcarbonylgruppe.

(x) R^U-RH-C- , worin R^u die unter (i) definierte Bedeutung besitzt und zusätzlich Wasserstoff, niedrig-Alkyl· oder durch Halogen substituiertes niedrig-Alkyl sein kann und Y Sauerstoff oder Schwefel darstellt. Ein Beispiel für eine derartige Gruppe ist

-CH₂

(xi) (CH_o)>w ^.C-CO- , worin X die vorstehend unter

^CH2 X . -

(viii) definierte Bedeutung besitzt und η eine ganze Zahl von

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1 bis 4 darstellt. Ein Beispiel für eine derartige Acylgruppe ist die I-Aminocyclohexancarbonylgruppe.

(xii) Aminoacyl, beispielsweise R^WCH(NH₂).(CHp)_nCO-, worin η eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist oder NHp-C Hp_Ar(CHp) CO, worin m die Bedeutung von Null qder einer ganzen Zahl von 1 bis 10 besitzt und η 0, 1 oder 2 ist, R^w ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aralkyl- oder Carboxygruppe oder eine, wie vorstehend unter R definierte Gruppe darstellt und Ar eine Arylengruppe ist, z.B. die p-Phenylen- oder 1,4-Naphthylengruppe. Beispiele für solche Gruppen sind in der britischen Patentbeschreibung 1 054- 806 aufgeführt. Eine Gruppe dieser Art ist die p-Aminophenylacetylgruppe. Andere Acylgruppen dieser Art schließen z.B. ein D-5-Amino-5-carboxypentanoyl, abgeleitet von natürlich vorkommenden Aminosäuren und deren Derivate, z.B. N-Benzoyl- £-aminoadipoyl.

(xiii) Substituierte Glyoxylylgruppen der Formel R·^.CO.CO-, worin R^ eine aliphatische, araliphatische oder aromatische Gruppe ist, z.B. eine Thienylgruppe, eine Phenylgruppe, eine mono-, di- oder trisubstituierte Phenylgruppe, wobei die Substituenten beispielsweise ein oder mehrere Halogenatome (F, Cl, Br oder I), Nethoxygruppen, Methylgruppen oder Aminogruppen oder ein' kondensierter Benzolring sind. Eingeschlossen in diese Gruppe sind auch die cy-Carbonylderivate der vorstehend substituierten Glyoxylylgruppen, z.B die of-Hydroxyimino-, cv-Alkoxyimino- und tx-Acyloxyiminoderivate. Ein Beispiel für ein derartiges Of-Carbonylderivat ist die 2-Hydroxyimino-2-phenylacetylgruppe.

(xiv) Formyl.

(xv) Kohlenwasserstoffoxycarbonyl- und substituierte Kohlen-

üarbonyl
wasserstoffoxy^ruppen (worin die 7-Aminogruppe den Teil eines Urethans bildet), insbesondere niedrig-Alkoxycarbonylgruppen (wie die Methoxycarbonyl-, Äthoxycarbonyl- und besonders bevor-

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zugt t-Butoxycarbonylgruppen); Halogen-niedrig-alkoxycarbonylgruppen, z.B. 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl; Aralkoxycarbonylgruppen wie Benzyloxycarbonyl-, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl-, Diphenylmethoxycarbonyl- und 4~Nitrobenzyloxycarbonylgruppen. Cycloalkoxycarbonylgruppen können auch verwendet werden, z.B. die Adamantyloxycarbonylgruppe.

(xvi) Haloformyl-, z.B. die Chlorformylgruppe.

Der Kern der aromatischen Gruppe Ar in der Formel (I) kann carbocyclisch oder ein 5- oder 6-gliedriger Heterocyclus sein, der ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus 0, N und S, enthalten kann. Beispiele für solche Kerne sind: Phenyl, Naphthyl, Thienyl, Pyridyl und Puryl. Als elektronanziehende Substituenten sind Nitrogruppen bevorzugt; andere elektronenziehende Substituenten schließen Cy an ο gruppen', Pormyl gruppen, Alkylcarbonylgruppen und Alkoxycarbonylgruppen ein, unter denen niedrig-(C_y,-C_j^)-Alkylcarbonyl- und niedrig-(C_y.-C^)-Alkoxycarbonylgruppen bevorzugt sind, z.B. Acetyl-, Carbäthoxy- oder Carbomethoxygruppen.

Es ist wünschenswert, zwei oder mehrere elektronenziehende Gruppen in der Gruppe Ar vorliegen zu haben, insbesondere wenn der individuelle elektronenziehende Effekt jeder dieser Gruppen nicht groß ist.

Wenn die in Ar vorhandene aromatische Gruppe eine Phenylgruppe ist, so liegen die elektronenziehenden Gruppen in den ortho- und/oder p^ra-Stellunpren, um eine maximale Konjugation mit der -CH=GH-Doppelbindung· sicherzustellen. Wenn Ar eine heterocyclische aromatische Gruppe enthält, so liegt bzw. liegen die elektronenziehende Gruppe bzw. die elektronenziehenden Gruppen ebenfalls so, daß eine Konjugation sichergestellt ist.

Bevorzugt sind solche Gruppen, worin Ar 4-Nitrophenyl, 2-Nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl oder 2,6-Dinitrophenyl ist. Alle diese "Verbindungen ergeben eine orangefarbene od-er rote

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Farbe, wenn der ß-Lactamring geöffnet wird. Die 2,4-Dinitrophenylverbindungen ergeben eine besonders starke und charakteristische rote Farbe. Eine Verbindung von besonderem. Interesse ist die, worin Ar 2,4-Dinitrophenyl und R Thienylacetamido darstellen, z.B. (6R,7R)-3-(E-2,4-Dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure der Formel

(H)

H-CH -/ V-

und deren Salze.

Verbindungen, worin Ar 4—Cyanophenyl ist, können verwendet werden, wenn aus irgendeinem Grund eine grüne Farbe bevorzugt wird.

Verbindungen der allgemeinen Formel I fallen unter die allgemeine Verbindungsklasse, die in der belgischen Patentschrift 761 897 beschrieben ist, jedoch sind die einzigen darin speziell beschriebenen Verbindungen, worin Ar eine aromatische Gruppe ist, die mindpstens eine elektronenziehende Gruppe trägt, solche Verbindungen v/orin Ar eine 4-Nitrophenylgruppe ist.

So stellen ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung neue Verbindungen dar, Verbindungen der ollgemeinen Forme]. I und Garboxylatderivate, z.B. Salze und wasserlösliche Ester davon, wie sie vorstehend definiert wurden, wobei jedoch Ar nicht die 4-Nitrophenylgruppe bedeutet. Vorteilhafte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindurp- sind Verbindungen, worin Ar die 2,4-Dinitrophenylgruppe darstellt.

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Die neuen Verbindungen können nach den allgemeinen Methoden hergestellt werden, die in der vorstehend aufgeführten belgischen Patentschrift enthalten sind, z,B. durch (a) Umsetzung einer Verbindung der Formel

COOR

(III)

worin R und X wie vorstehend definiert sind, R Wasserstoff

■z oder eine Carboxyl-blockierende Gruppe darstellt und R^ einen organischen Substituenten bedeutet, mit einer Aldehydverbindung der Formel ArCHO, worin Ar die vorstehend definierten Bedeutungen besitzt, jedoch keine 4-Nitrophenylgruppe darstellt, oder . ■

(b) Umsetzung einer Verbindung der Formel

(IV)

COOR

worin R, X und R wie vorstehend unter (a) definiert sind, mit einem Phosphoran-ylid der Formel

(R⁵) ,P = CHAr (V)

worin R und Ar wie vorstehend unter (a) definiert sind, worauf, falls notwendig oder gewünscht, eine der folgenden Umsetzungen (c) durchgeführt wird:

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(i) Umwandlung eines A -Isomeren in das gewünschte Δ -Isomere;

(ii) Reduktion einer Verbindung, in der X die Gruppe -SO-darstellt, zu einer Verbindung, worin X die Bedeutung von -S-besitzt;

(iii) Oxydation einer Verbindung, worin X die Bedeutung von -S- besitzt, zu der Verbindung, worin X die Bedeutungen -SO- oder -SOp- besitzt oder Oxydation einer Verbindung, worin X die Gruppe -SO- darstellt, zu der Verbindung, worin X die Bedeutung von -SOp- besitzt;

(iv) Umwandlung einer blockierten Aminogruppe R in eine freit Aminogruppe;

(v) Umsetzung einer Verbindung, worin H eine freie Aminogruppe ist, mit einem Reagens, das dazu dient, diese Aminogruppe in eine blockierte Aminogruppe umzuwandeln, z.B. mit einem acylierenden Derivat einer Carbonsäure;

(vi) Isomerisierung (cis^-^trans) der exocyclischen -CH=CH-Doppelbindung;

(vii) Entfernung einer Carboxyl-blockierenden Gruppe von der 4-Carboxylgruppe und/oder Entfernung von Amino- oder Carboxylgruppen schützenden Gruppen, die in einer blockierten Aminogruppe R vorhanden sind; und/oder

(viii) Bildung eines Carboxylatderivats, z.B. eines Salzes oder eines wasserlöslichen Esters der 4-Carboxylgruppe.

In Abhängigkeit von der Art und der Natur der Substitution in der Gruppe Ar in der Formel (I) können entweder das eis- oder trans-Isomere im Sinne der Bildung einer etwas tieferen und intensiveren Farbe vorteilhafter sein als das andere Isomere oder alternativ im Hinblick auf eine verbesserte Wasserlöslich-

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keit. Im allgemeinen sind jedoch die trans-Isomeren bevorzugt. Die Isomerisierung kann durch eine geeignete chemische Behandlung, z.B. mit Tri-fluoressigsäure und Anisol,oder durch Bestrahlung bewirkt werden.

Die Methode zum Test einer biologischen Probe, die ein Merkmal der vorliegenden Erfindung darstellt·, ist besonders zum Test auf die ß-Lactamaseaktivität, insbesondere in Bakterienkulturen, von Interesse. Es ist bekannt, daß die Widerstandsfähigkeit einiger Bakterienstamme gegen die antibakterielle Wirkung von Cephalosporin- und Penicillinverbindungen durch die von den Bakterien erzeugten ß-Lactamaseenzyme bewirkt wird, wobei die Enzyme ausreichen, um bei normalen Dosierungen die Cephalosporine und Penicilline zu zerstören und zu inaktivieren. Bisher war die Identifizierung solcher Bakterienstämme sehr schwierig und erforderte im allgemeinen-die Aufzucht einer Kultur, Inkubation mit einer ß-Lactamverbindung und schließlich den Zusatz eines weiteren Reagens, um eine Farbanzeige für die Anwesenheit des im Ring geöffneten Lactams zu ergeben.

Im Gegensatz dazu wird durch die vorliegende Erfindung eine schnelle und positive Anzeige der ß-Lactamaseaktivität ermöglicht. Hierzu ist es lediglich notwendig, die Bakterienkultur mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder einem Derivat davon in Kontakt zu bringen. Im Falle einer Kultur, die eine hohe Konzentration einer aktiven ß-Lactamase enthält, kann man fast unmittelbar eine Färbung feststellen; wenn nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37° mit der Testverbindung keine Farbe auftritt, kann daraus geschlossen werden, daß die ß-Lactamaseaktivität sehr gering oder nicht vorhanden ist.

Der elektronenziehende Substituent oder die elektronenziehenden Substituenten in der Gruppe Ar machen den ß-Lactamring besonders labil, und es ist daher nicht wahrscheinlich, daß ein Bakterienstacim, der mit der Testverbindung keine positive Anzeige- der 'ß-Lactamaseaktivität ergibt, eine Ringöffnung bei einer chemo-

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therapeutisch bedeutsamen Cephalosporin- oder Penicillinverbindung bewirkt.

Die Erzeugung einer Farbe ist ein wertvolles Merkmal der vorliegenden Erfindung, da die ß-Lactamaseaktivität qualitativ bestimmt werden kann, ohne daß dabei auf Spektrophotometer oder andere optische Instrumente zurückgegriffen werden muß.

Die Anwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) auf die Probe kann verschiedenartig durchgeführt werden. Im Falle von Bakterienkulturen können ein oder mehrere Tropfen der Testlösung (das Lösungsmittel ist gewöhnlich Wasser, gegebenenfalls vermischt mit einer geringeren Menge eines organischen Lösungsmittels, z.B. Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid) zu einer Probe der Kulturbrühe oder auf eine Agar-Platte getropft werden.

Ii

Der Test kann durch Standardisierung der Konzentrationen und Volumen von Probe und Testreagens sowie der Inkubationsperiode quantitativ gestaltet werden, wobei die Intensität der Farbe entweder mit einem Spektrophotometer oder einer anderen Art von optischem Vergleichsgerät gemessen wird.

Die auf einer Agar-Platte entwickelte Farbe ist nicht stabil und beginnt bei 37° in etwa drei Stunden zu verblassen. Durch Kulturbrühen erhaltene Farben bleiben normalerweise für mindestens 24 Stunden stabil. Es ist empfehlenswert, den Test nach 30 Minuten und vor Ablauf von 3 Stunden, beginnend mit der Zeit der Zugabe des Reagens, abzulesen.

Es sollte in Betracht gezogen werden, daß die Verbindungen der Formel I eine antibakterielle V/irkung besitzen und daß daher ein Versuch, einen Organismus in Anwesenheit der Testverbindung zu kultivieren, nicht zu einem' befriedigenden Test der ß-Lactamaseaktivität führt, insbesondere im Falle von grampositiven Bakterien; im allgemeinen wird die Kultur aufgezogen und anschließend mit der Testverbindung behandelt. Diese Behand-

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lungsmethode ist insbesondere für den Fall von Agar-Kulturen zweckmäßig.

Sehr häufig wird lediglich eine qualitative Anzeige für die ß-Lactamaseaktivität erforderlich, und hierfür ist es zweckmäßig, die Testverbindung, imprägniert in ein Absorptionsmittel jeglicher geeigneter Größe oder Form, das z.B. aus einem absorbierenden Cellulosematerial, z.B. Papier, besteht, zu verwenden. Zweckmäßig kann dieses Mittel in der Form einer Scheibe dicken Papieres vorliegen, das auf eine Agar-Kultur gelegt werden kann, wodurch die Verwendung einer Lösung des Testreagens vermieden werden kann. Zur Anwendung in Kulturbrühen oder anderen flüssigen Proben liegt das Absorptionsmittel zweckmäßig in länglicher Form vor, um ein Eintauchen in die Probe zu ermöglichen. Die Herstellung von Testreagentien, die in Scheiben,oder Stäbchen imprägniert sind, ist per se bekannt. Die Imprägnierung wird im allgemeinen mit einer wäßrigen Lösung der Testverbindung oder vorzugsweise eines Salzes davon durchgeführt. Wenn die Wasserlöslichkeit nicht ausreicht, so kann ein organisches Lösungsmittel, z.B. Dimethylformamid, entweder allein oder in¹wäßriger Lösung verwendet werden. Die Konzentration einer Imprägnierungslösung, die zur Erzielung einer ausreichenden Farbänderung mit irgendeinem Reagens nötig ist, kann leicht experimentell bestimmt werden. Im allgemeinen sind Konzentrationen in der Größenordnung von 1 mg/ml ausreichend. Schließlich wird das Lösungsmittel.durch leichtes Erwärmen, gegebenenfalls unter vermindertem Druck, verdampft.

Die Absorptionsmittel sollten weiß oder hell sein, so daß die beim Test erzeugte Farbe nicht undeutlich wird. Es ist zweckmäßig, eine übermäßige Lichteinwirkung vor dem Gebrauch durch eine geeignete Verpackung zu vermeiden.

Dementsprechend besteht ein weiteres Merkmal der Erfindung in einem Testmaterial zur Anwendung für Tests auf die ß-Lactamaseaktivität, das aus einem weißen oder hellen Absorbiermittel, z.B. Papier, besteht, das mit einer Verbindung der allgemeinen

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Formel I oder einem wasserlöslichen Carboxylatderivat, z.B. einem Salz davon, imprägniert ist.

Veiter wird durch die Erfindung ein analytisches Reagens zum Test auf die ß-Lactamaseaktivität geschaffen, welches in einer Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines Derivats davon mit einer Konzentration von 10-2000 jug/ml, z.B. 50-250 juig/ml, vorzugsweise in Wasser oder Wasser, das eine geringe Menge, z.B. 0,1-10 % Vol./Vol., eines organischen Lösungsmittels, wie Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, enthält, besteht.

Die vorliegende Verbindung ist für die Pathologie interessant, wenn es häufig erwünscht ist, herauszufinden, ob ein Bakterienstamm befähig ist, ß-Lactamase zu produzieren. Diese Information beeinflußt die Wahl des zur Bekämpfung eines besonderen Stammes zu verwendenden Antibiotikums, ohne daß es nötig ist, den Stamm präzise zu identifizieren. Eine Vielzahl von Bakterien, granspositive wie gram—negative, von denen es bekannt ist, daß sie' ß-Lactamasen produzieren, haben sich als auf den erfindungsgemäßen Testvorgang positiv reagierend erwiesen. Beispiele umfassen Enterobacter cloacae P 99, E. coli TEIl, Klebsiella aerogenes Kl, Staph. aureus, Pseudomonas aeruginosa und Bacillus licheniformis. Gram-positive Organismen neigen zu einer Empfindlichkeit gegen die antibakterielle Wirkung der Testverbindungen und sollten immer vor dem Test kultiviert werden.

Eine weitere wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikrobiologischen Forschung, insbesondere der übertragbaren K-Faktoren, die die ß-Läctamaseproduktion vermitteln. R-Faktoren sind extrachromosome genetische Elemente, die für die Übertragung von antibiotischer Resistenz von resistenten BaK erien auf bisher beeinflußbare Stämme verantwortlich sind. Die Existenz dieser Übertragungsmechanismen findet gegenwärtig wegen der weit verbreiteten Anwendung von Antibiotika für relativ geringfügige Leiden und in

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tierischen Futterstoffen große Beachtung. Wenn die Übertragung ■ der Resistenz die Fähigkeit, ß-Lactamase zu erzeugen, einschließt, so wird durch die vorliegende Erfindung eine einfache Methode dafür geschaffen aufzuzeigen, ob der R-Faktor vorhanden ist oder nicht.

Eine andere mögliche Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt darin, im Urin von Patienten mit Infektionen im Harntrakt, die durch ß-Lactamase erzeugende Organismen verursacht wurden, anzuzeigen.

Neben der Möglichkeit für einen empfindlichen Test auf ß-Lactamasen ergeben die Verbindungen der allgemeinen Formel I und ihre Salze auch mit gewissen anderen organischen Materialien wie Eiweiß und Serumalbumin eine positive Anzeige. Dies ist zu beachten, wenn auf die ß-Lactamaseaktivität getestet wird. Es wird angenommen, daß die positive Reaktion aufgrund von Thiolgruppen in diesen Materialien erfolgt. Einen positiven Test ergeben auch Glutathion und Mercaptoäthanol. Thioglykolsäure ergibt eine schwach positive Reaktion. Von 20 getesteten Aminosäuren ergab lediglich Cystein eine positive Reaktion. Verbindungen, die Thiomethyl- oder Disulfidgruppen enthalten, ergaben keinen positiven Test.

Wegen dieser Empfindlichkeit der Testverbindungen für Materialien wie Serumalbumin kann es vorteilhaft sein, beim Test auf die ß-Lactamaseaktivität zuerst eine Blindprobe zu machen, d.h. daß keine ß-Lactamase enthaltende Medium zu testen, um sicherzugehen, daß kein solches störendes Material vorhanden ist, das möglicherweise gefälschte Ergebnisse erzeugen könnte.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Testreagentien wird vorzugsweise ein fast neutraler pH angewendet, z.B. im Bereich von 5,5 bis 8,5« Extreme pH-Werte zerstören das Reagens und inakti-r vieren bei einem Test auf die ß-Lactamaseaktivität auch das Enzym.

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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Die folgenden allgemeinen Informationen gelten für alle Beispiele, so weit nicht anders ausgeführt.

Bei Petroläther wurde die Fraktion mit Kp. 40 bis 60⁰C verwendet, Protonenmagnetische Resonanzepektren (PMR) wurden bei 100 MHz gemessen. Signale für die Kopplungskonstanten wurden nicht zugeordnet. Die Integrale stimmten mit den zugeordneten Strukturen überein.

Elektrophorese wurde an Whatman 3MM-Papier beim pH 1,9 und einem Spannungsgradienten von etwa 25 Volt/cm durchgeführt. Die Beweglichkeiten (M) (gegen die Kathode) beziehen sich auf Dextranblau.

Säulenchromatographie wurde an Merck-Kieselgel (0,05 - 0,2 mm) durchgeführt.

Dünnschichtchromatographie wurde aufwärts an Merck GFpr/,. *£-£■ Siliciumdioxydplatten durchgeführt, zur Entwicklung wurden die folgenden Lösungsmittel verwendet:

System A Obere Phase aus n-Butanol:i'!thanol:Wasser » 4:1:5, bei Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht.

System D Benzol :Äthylacetat = 5"·1·
System E Benzol:Äthylacetat = 2:1.
System F Chloroform:Petroläther:Aceton =20:5:1-

Papierchromatographie wurde in folgenden Systemen durchgeführt:

System B Whatman No. 1 Papier, gepuffert auf pH 6, abwärts entwickelt bei ca. 25° mit einer oberen Phase von n-Butanol: Äthanol:Wasser = 4:1:5, im Gleichgewicht mit der Bodenphase.

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System C Whatman No. 1 Papier, gepuffert auf pH 5, abwärts entwickelt bei 37°C mit der oberen Phase aus n-Butanol:Äthylacetat:0,1m-Natriumacetat = 1:8:8, im Gleichgewicht mit der unteren Phase.

System B n-Butanol:Äthanol:Wasser = 4:1:5, bei Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht, die obere Phase wurde als Entwickler der abwärts wandernden Art verwendet, im Gleichgewicht mit der unteren Phase, auf Whatman 3MM-Papier, gepuffert auf pH 6 mit. 0,05m-Natrium~ dihydrogenphosphat.

System C Äthylacetat:n-Butanol:0,1m-Natriumacetat vom pH 5 = 8:1:8, bei 38⁰C ins Gleichgewicht gebracht, die obere Phase wurde in absteigender Art als Entwickler verwendet, im Gleichgewicht mit der unteren Phase bei 38⁰C, auf No. 1 Whatman-Papier, gepuffert auf pH 5 mit G^im-Natriumacetat..

Die folgenden Abkürzungen wurden.für das Aussehen der Flecken (spots) verwendet: s = stark, m = mittel, f = schwach.

PMR- und IR-Spektren standen in Einklang mit den zugeordneten Strukturen.

Die in den Beispielen 1(a) und 1(b) als Ausgangsmaterialien verwendeten Cephalosporinderivate wurden,wie in der vorstehend genannten belgischen Patentschrift 761 897 beschrieben, hergestellt.

Beisj3iel_1

(A) DiOhenylmethyl-(6R,7R)-3-(g,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ce-oh-3-eri^-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

(a) Eine Lösung von 9,8 g (50 mMol)"2,4—Dinitrobenzaldehyd in 500 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei etwa 23° gerührt

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und 7,65 g (10 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(triphenylphosphor anylidenmethyl)-~7-(2-thienyl ac et amido )-ceph-3-em-4-carboxylat wurden portionsweise während 45 Hinuten zugefügt. Nach weiterem 40-minütigen Rühren wurde die Lösung durch Filtration durch einen Kieseiguhrpfropfen geklärt, auf etwa 50 ml konzentriert und durch Chromatographie an 300 g Kieselgel mit Chloroform als Eluiermittel gereinigt.

Eindampfen des Eluates ergab 15,326 g eines Gels, das in 15 ml Benzol gelöst wurde; diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 300 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat » 10:1 als Eluiermittel gereinigt.

Fraktionen mit R--Werten von etwa 0,5 (System D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft, und der erhaltene Schaum (4,226 g, 61,5 %) mit 25 ml Äther angerieben, wobei sich 3,493 ς (51,2 %) des Titelesters in Form von gelben Schuppen ergaben, F. m 88 bis 108° (Zers.) ;[<*] ^⁰ . -443° (c = 0,9, CHCl,), Λ. _v (ÄtOH) 287 nm (t 11 300) und 375 nm (£ 1'1.80O)₁ Inflexion bei 235 nm (ε 24 700); das PMR-Spektrum (CDCl,) zeigte an, daß'dieses Material eine Mischung (etwa 85:15) der Z- und Ε-Isomeren war.

(b) Eine Lösung von 29,4 g (0,15 Mol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in 250 ml Methylenchlorid wurde heftig mit 750 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Wasser =1:1 gerührt und eine Lösung von 42,2 g (0,05 Mol) (6R,7R)-/4-Diphenylmethoxycarbonyl-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl}-triphenylphosphoniumbromid in 250ml Methylenchlorid wurde während 30 Minuten zugetropft.

Nach weiterem 30-minütigen Rühren wurde die organische Phase abgetrennt, auf etwa 100 ml konzentriert und durch Chromatographie an 1,4 kg Kieselgel mit etwa 5 1 Methylenchlorid, gefolgt vorl etwa 13 1 Chloroform als Eluiermittel, gereinigt. Eindampfen des Chloroformeluats ergab 40,8 g eines Schaums, der in 40 ml Benzol gelöst wurde; diese Lösung wurde weiter durch Chromato-

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graphie an 600 g Zieselgel mit Benzol:Äthylacetat =10:1 als Eluiermittel chromatographiert.

Fraktionen mit R„-Werten von etwa 0,5 (System D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Schaum (19,7 g, 58 %) wurde mit 100 ml Äther angerieben und die Suspension unter Bildung von 15,765 g (46,3 %) des Titelesters in Form von orangefarbenen Schuppen filtriert; F. 104 bis 116° (Zers.); Hd° = -W⁰ (c = ¹^, ⁰¹¹⁰V^nIa_x. (ÄtOH) 287 nm (£10 450) und 375 nm (£ 17 000), Inflexion bei 235 nm (ε 24 000); das PMR-Spektrum (CDCl₅) zeigte an, daß diese Probe eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und Ε-Isomeren war.

Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther eingegossen, wobei sich ein zweiter Kristallanschuß von 1,344 g (4 %) des Titelsters als amorpher orangefarbener Feststoff ergab, F. = 86 (Zers.); [ei] S⁰ = -416° (c = 1,1, CHCl-,); A_mov (ÄtOH) 280 nm (£ 11 300) und 363 nm (£ 10 600), Inflexion bei 235 nm (ε 23 900); das PMR-Spektrum (CDCl₅) zeigte an, daß dieses Material hauptsächlich aus dem Z-Isomeren bestand.

Das IR-Spektrum und chromatographische Charakteristika dieser beiden Proben waren denen vorstehend unter (a) beschriebenen ähnlich.

(B) 3-(2,4-Dinitrostyryl)-(6R,7R)-7-(2-thienylacet3mido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres

Eine Lösung von.11,0 g (16,1 mMol) Diphenylmethyl-(6B_v,7R)-3-(2,4-dinitro styryl)-7-(2-thienyl acetamido )-ceph-3-em-^z»— Carboxylat (Z-Isomeres mit etwa 20 % Ε-Isomerem) in einer Mischung von 44 ml Trifluoressigsäure und 11 ml Anisol wurde 7 Minuten bei 23° gehalten und anschließend die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt.

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10 ml Äthylacetat wurden zugefügt, die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 75 ml Äther angerieben, wobei.sich 7)359 g (88,6 %) der Titelsäure in Form eines orangefarbenen Feststoffes ergaben, F. 103 bis 113° (Zers.), Ja] ^⁰ » -224° (c = 1,0, Dioxan),2_mov (ÄtOH) 231 nm (£ 24 300), 289 nm (£ 10 300) und 386 nm (f 18 000),2 _{m v} (0,1m-pH 6 Phosphatpuffer) 233 nm (£22 200), 290 nm (£12 200) und 391 nm (ε 17 400); das PMR-Spektrum (DMS0-d₆) umfaßt die τ-Werte: 2,37 und 2,72 (CH=CH, zwei Dubletts, J Ί6 Hz), 4,73 (C/gv-H, Dublett, J 5 Hz) und 5,94 und 6,26 (C,^-H, AB-Quartett, J_Aß 18 Hz). R_f 0,42 (System B) und 0,82 (System C).

Beisp_iel_2

(A) Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-_[Jodmethyl-7-(2^l-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat

Eine Lösung von 43,7 g Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-chlormethylr-7-(2'-t-butoxycarbonylamino,-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat in 2.50 ml Aceton wurde mit einer Lösung von 45 g Natriumiodid in 250 ml Aceton behandelt. Die Mischung wurde zwei Stunden in der Dunkelheit gerührt, dann in .2 1 verdünnte Kochsalzlösung gegossen und alles zusammen mit 2 χ 500 ml Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser und wäßriger 1%iger Natriumthiosulfatlösung und mit weiteren Wassermengen gewaschen, getrocknet und im "Vakuum auf etwa 150 ml eingedampft.

Diese Lösung wurde in 2,5 1 kräftig gerührten Petroläther (Kp. 40 bis 60°) gegossen, wobei sich 44,4 g (89 %) der Jodmethylverbindung in Form, eines amorphen sahnefarbenen Feststoffes ergaben, F. 110 bis 127° (Zers.) ;[<*] ψ . -53,5° (c = 1,0, CHCl₃),λ _max> (ÄtOH) 282 nm (£ 7 850).

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(B) Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(2^-dinitrostyryl)-7-(2'-tbutoxy carbonylamiηο-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 2,958 g (4 mMol) Diphenylmethyl (2'R,6R,7R)-3-jodmethyl-7-(2^l-t-butoxycarbonylamino-2^l-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat in 50 ml trockenem Methylenchlorid wurde in der Dunkelheit bei 23° gerührt, und eine Lösung von 1,574- g (6 mMol) Triphenylphosphin in_ 25 ml Methylenchlorid wurde während- 5 Minuten zugetropft. Die Lösung wurde eine weitere Stunde gerührt und anschließend tropfenweise während 15 Minuten zu einer heftig gerührten Mischung von 2,353 g (12 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in 50 ml Methylenchlorid und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Wasser =1:1 getropft. Nach weiterem 40-minütigem Rühren wurde die organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 100 g Kieselgel mit etwa 1 1 Methylenchlorid, gefolgt von etiira 1 1 Chloroform, als Eluiermittel gereinigt.

Durch Eindampfen des Chloroformeluats ergaben sich 3,43 g eines Schaums, der in 10 ml Benzol gelöst wurde. Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 80 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat = 10:1 als Eluiermittel gereinigt. !Traktionen mit R„-Werten von etwa 0,5 (System D) wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Schaum (1,74 g, 55 %) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther eingegossen^ wobei sich 1,489 g (47 %) des Titelesters in Form eines amorphen gelben Feststoffs vom F. 112 bis 119° (Zers.) ergaben; fo6]23 ₌ _₅₁₆o (_{c = 1i08j} CHC₁) % (ÄtOH) 282 nm (£ 11 200) und 368 nm (£. 12 100); das PMR-Spektrum (CDCl,; zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 85:15) der Z-. und Ε-Isomeren war. R„ 0,51 (System D) und 0,35 (System F).

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(C) (2'R,6R,7R)-7-(2'-Amino-2'-phenylacetaniido)-3-(2,4- dinitro styryl)-ceph-^-em-A—carbonsäure, Trifluoressigsäuresalz, Ε-Isomeres

Eine Lösung von 1,30 g (1,64 mMol) Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit etwa 15 % E-Isomerera) in einer Mischung von 10 ml Trifluoressigsäure und 2,5 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 25 gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt.

20 ml Äthylacetat wurden zugesetzt, die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 20 ml Äther angerieben, wobei.sich 998 mg (95 %) des Trifluoressigsäuresalzes in Form eines gelben Peststoffs vom F. 156 bis 163° (Zers.) ergaben. \ (ÄtOH)

IuSjC ·

280 nm (C 10 000) und 387 nm (613 100); das PMR-Spektrum (DMS0-d₆) umfaßte die T-Werte 2,33 und 2,82 (CH=CH, zwei Dubletts, J 16 Hz), 4,80 (C^-H, Dublett, J 5 Hz) und 6,07 und 6,37 (C/^-H, AB-Quartett, J_Aß 18 Hz).

Beispiel 3

(A) Diphenylmethyl~(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)~7-(2-thienyl- acetamido)-ceph-?-em-4-carboxylat, Z- und E-Isomere

(a) Eine Lösung von 1,2 g (16 mMol) 4-Nitrober;zaldehyd in 100 ml Methylenchlorid wurde in der Dunkelheit bei 23 mit 100 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:"asser =1:1 gerührt und 1,786 g (2 mMol) (6R,7R)-[4-Diphenylmethoxycarbonyl-7-(2-thienyl acet amido )-ceph-3-em-4-ylmethyl J-triphenylphosphoniuüijodid wurden portionsweise wahrend 20 Minuten zugefügt.

Nach weiterem 40-minütigen Rühren wurde die organische Schicht getrennt, mit 100 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, auf etwa 20 ml konzentriert und durch Chromatographie an 120 g Kieselgel mit 1 1 Methylenchlorid, gefolgt von 1 1 Chloroform.

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als Eluiermittel, gereinigt» Eindampfen des Chloroformeluats ergab 1,46 g eines Schaums, der in 10 ml Benzol gelöst wurde; diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 30 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat = 10:1 als Eluiermittel gereinigt.

Fraktionen mit R„-Werten von etwa 0;5 /(System D) wurden vereint und im Vakuum verdampft, wobei sich 900 mg (70,6 %) eines öligen Feststoffs ergaben. Dieser Feststoff wurde mit 50 ml Methanol digeriert, wobei sich 175 mg (13,7 %) des Ε-Isomeren in Form von gelben Nadeln, vom F. 239 bis 242° (Zers.) ergaben; fej ψ = -177° (c = 0,94-, CHCl₃,), λ (ÄtOH) 368 nm

XJ y in α JL ■

(£ 27 300), Inflexionen bei 295 nm (S 8 300) und 235 nm (6 20 300), R_f 0,52 (System D), 0,70 (System E) und 0,60 (System F).

Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther eingegossen, wobei sich 480 mg (37,6 %) des Z-Isomeren in Form eines blaßgelben, amorphen Feststoffs vom F. 85 bis 91° (Zers.) ergaben; fo6]§⁵ » -435° (c = 0,81, CHCl₅), /l_max._ (ÄtOH) 3^4 nm (6 13 500) und 283 nm (£ ίθ 800), Inflexion bei 235 nm (£ 18 600). R_f 0,52 (System D), 0,70 (System E) und 0,60 (System F).

(b) Eine Lösung von 3,0 g (20 mMol) 4-Nitrobenzaldehyd in 100 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei 23° gerührt und 3,83 g (5 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-triphenylphosphoranyliden-methyl-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat wurden portionsweise während einer Stunde zugesetzt. Nach weiterem einstündigem Rühren wurde- die Lösung auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 100 g Kieseüjgel mit Chloroform als Eluiermittel gereinigt.

Das Eluat wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 100ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 χ 100 ml), Wasser (2 χ 100 ml) und 100 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und unter Bildung von 7,91 ^:g eines öligen Feststoffs eingedampft. Dieser Feststoff wurde in

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80 ml Benzol gelöst und die Lösung weiter durch Chromatographie an 160 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat » 10:1 als Eluiermittel gereinigt.

Durch Vereinigung der Fraktionen mit E„-Werten von etwa 0,5 (System D) erhielt man 2,05 g (64 %) eines Schaums, der in Äthylacetat gelost wurde. Die Lösung wurde in Petroläther eingegossen, wobei sich 1,64 g (51,5 %) des Titelesters in Form eines gelben, amorphen Feststoffs vom F. 90 bis 95 (Zers.) ergaben. [«] Jp _m _₄₂5° (_{c β 0},69, CHCl₅) ;\_ax# (AtOEi) 561 nm (Z- 18 700), Inflexionen bei 283 nm (£ 18 900) und 235 nm (e 18 700); das PMR-Spektrum (CDCl,) zeigte an, daß das Material eine Mischung (etwa 3:1 der Z- und Ε-Isomeren mit Signalen bei τ 3,40 (CH=CH) und 6,68 und 7,01 (C^-H) für des Z-Isomere und bei T 2,48 und 3,35 (CH=CH) und 6,29 und 6,50 H) für das Ε-Isomere war. .

(B) 3-(4-Nitrostyryl)-(6R₁7R)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres

303 mg (0,475 JnMo1) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Ε-Isomeres, wurden mit 1,2 ml Trifluoressigsäure und 0,3 ml Anisol behandelt und nach 5 Minuten wurden die Reagentien bei 40° (2 mm) eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung (300 ml, 2 χ 50 ml) extrahiert, der Extrakt mit 200 ml Äthylacetat überschichtet und auf pH 2 mit 2n-Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 50 ml Wasser und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 145 mg (65 %) eines Feststoffs eingedampft.

Anreiben dieses Feststoffs mit 20 ml Äther ergaben 95 mg (42 %) der Säure in Form von gelben Plättchen vom F. 173 bis 191° (Zers.).M?^? = -42° (c = 0,75, Aceton), λ (0,1m-pH 6

D ΓΠ9Χ ·

Phosphatpuffer) 233 nm (£16 200) und 375 nm (L 21 600),'

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Inflexion bei 300 nm (£10 100), X (ÄtOH) 232 mn (g: 16 100)

III 3.X ·

und 372,5 nm (C 22 600), Inflexion bei 291 nm (e 8 200); das PMR-Spektrum (DMS0-d₆) zeigte die T-Werte 2,32 und 2,84 (CH=CH, zwei Dubletts, J 16 Hz), 4,76 (G^-E, Dublett J 5 Hz) und 5,88 und 6,26 (C^-H, AB-Quartett, J_Aß 18 Hz); R_f 0,55 (System B), und 0,81 (System C).

■ (C) -(6H,7R)-3-(4-Nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceOh-3-em-4-carbonsäure, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 1,27 g (1,99 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres, in einer Mischung von 5 ml Trifluoressigsäure und 1,3 ml Anisol wurde 5 Minuten bei etwa 23° gehalten, die •Lösungsmittel wurden bei 40 (2 mm) entfernt und der Rückstand zwischen 100 ml Äthylacetat und 100 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Vasser =1:1 aufgeteilt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit 2n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH 2 angesäuert, mit 150 ml Äthylacetat extrahiert; der Extrakt wurde mit 100 ml Wasser und 100 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.

Der zurückbleibende Schaum (875 mg, 93 %) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 715 mg (76 %) der Säure als blaßgelber, amorpher Feststoff vom F. 95 bis 110° (Zers.) ergaben.Μψ = -307° (c = 1,15, Dioxan); (^Ät0H) ²52,5 nm (£16 700), 288 nm (£'11 100) und

371 nm (£ 17 600), X_mnv (0,1m-pH 6 Phosphatpuffer) 231,5 nm

ΙΠ3Χ · *

(£18 300), 284,5 nm (£ 13 100) und 355 nm (C 12 400); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 1:1) der .Z- und Ε-Isomeren mit Signalen bei T 3,26 (CH=CH, Singulett), 4,76 (C/gs-H, Dublett, J 5 Hz) und 6,37 und 6,80 (C/^-H, AB-Quartett, J^_ß 18 Hz) für das Z-Isomere und bei X 2,32 und 2,84 (CH=CH) und 5,88 und 6,26 (C,^-H) für das Ε-Isomere, war. R_f 0,55 (System B) und 0,81 (System C).

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Beisgiel_4

(A) DiOhenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2'-tbutoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-5-em-4-carboxylat, Z-Isomerea (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 1,479 g (2 mMol) (2'R,6R,7R)-3-Jodmethyl-7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat in 20 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei 23 in der Dunkelheit gerührt und eine Lösung von 787 mg (3 mMol) Triphenylphosphin in 10 ml Methylenchlorid wurde während 5 Minuten zugetropft. Die Lösung wurde während weiterer 90 Minuten gerührt und tropfenweise zu einer heftig gerührten Mischung von 1,2 g (8 mMol) 4-Nitrobenzaldehyd in 50 ml Methylenchlorid und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Wasser » 1:1 gefügt. Nach weiterem 40-minütigem Rühren wurde die organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 3>33 g eines öligen Feststoffs eingedampft.

Eine Lösung dieses Feststoffs in 10 ml Methylenchlorid wurde durch Chromatographie an 100 g Kieselgel mit etwa 1 1 Methylenchlorid, gefolgt von etwa 1,5 1 Chloroform als Eluiermittel, gereinigt. Durch Eindampfen des Chloroformeluats erhielt man 1,65 g eines Schaums, der in 10 ml Benzol gelöst wurde. Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 32 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat = 10:1, als Eluiermittel, gereinigt.

Durch Vereinigung der Fraktionen mit R„-Werten von etwa 0,5 (System D) ergaben sich 669 mg (45 %) eines Schaums, der in Äthylacetat gelöst wurde. Die Lösung wurde in Petroläther eingegossen, wobei sich 570 mg (38 %) des Esters als blaßgelber, amorpher Feststoff vom F. 111 bis 118° (Zers.) ergaben.

? = -329° (c = 0,92, CHCl,);/? _γ (ÄtOH) 285 nm (£ 9 000)

J J LIi i Λ

XJ J LIi ei .Λ. ·

und 359 nm (£ 18 600); das PMR-Spektrum (CDCl₅) zeigte an, daß dieses Produkt eine Mischung (etwa 7:3) der Z- und E-Isomeren war. R_f 0,52 (System D) und 0,40 (System F).

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(B) 3-(4-Nitrostyryl)-(2'R,6R,7R)-7~(2'-amino-'-phenylacetamido)-ceph-^-em-4-carbonsäure, Trifluoressigsäuresalz (Ε-Isomeres)

Eine Lösung von 500 mg (0,67 mMol) Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(4-nitrο styryl)-7-(2'-t-butoxyc arbonylamino-2'-phe nylacetamido )-ceph-3-em-4-carboxylat (Z:E «. 7·3) in einer Mischung von 4 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei gehalten, die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt und der Rückstand mit 20 ml Äther angerieben, wobei sich 350 mg (88 %) des Trifluoressigsäuresalzes in Form eines gelben Feststoffs vom F. 153 bis 156° (Zers.) ergaben. [<xj ψ = -212° (c = 0,9,

Dioxan), λ (ÄtOH) 290 nm (ε 9 450) und 372,5 nm (£.18 400); in 3.x *

das PMR-Spektrum (DMSO-dg) umfaßte die T-Werte 2,48 und 2,90 (CH=GH, zwei Dubletts, J 16 Hz), 483 (C^s-H, Dublett, J 5 Hz) und 6,02 und 6,40 (Ο,^-Η, AB-Quartett, J_Aß 18 Hz).

Beisp_iel_5

(A) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-cyanostyryl)-7-(2-thienylac e tamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z- und E-Isomere

Eine Lösung von 6,56 g (50 mMol) 4-Cyanobenzaldehyd in 250 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei 23 gerührt und 3,825 g (5 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(triphenylphosphoranylidenmethyl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat wurden portionsweise während zwei Stunden zugesetzt. Die Lösung wurde weitere 16 Stunden gerührt, auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 120 g Kieselgel mit etwa 2 1 Methylenchlorid, gefolgt von etwa 2 1 Chloroform, als Eluiermittei,-gereinigt.

Durch Eindampfen des Chloroformeluats ergaben sich 4,15 g eines Schaums, der in 20 ml Benzol gelöst wurde. Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 90 g Kieselgel mit Benzol: Äthylacetat = 10:1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit R_f-w"erten von etwa 0,45. (System D) wurden vereint und im Vakuum

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" ²⁸ " 22^9165

unter Bildung von 2,016 g (65 %) eines blaßgelben Peststoffs eingedampft. Dieser Feststoff wurde mit 50 ml warmem Methanol digeriert, die Suspension wurde auf etwa 23° gekühlt und die Feststoffe abfiltriert und im Vakuum unter Bildung von 615 mg (20 %) des Ε-Isomeren in Form von farblosen Nadeln vom F. 235 bis 237° (Zers.) getrocknet. [<xJ Jp = -194° (c = 0,83, CHCl₅); X (ÄtOH) 346,5 nm (£ 33 100), Inflexionen bei 257 nra (£ 11 200)' und 235 nm (ε 19 200). R_f 0,46 (System D) und 0,58 (System F).

Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 1,15 g (38 %) des Z-Isomeren in Form eines amorphen, farblosen Feststoffs vom F. 91 bis 97° (Zers.) ergaben. [a]rF⁼ -47,2° (c = 0,91, CHCl₃); X_maXi (ÄtOH) 326 nm (£" -|4 800) und 258 nm (£ 12 900), Inflexion bei 235 nm (£ 19 100). R_f 0,46 (System D) und 0,58 (System F).

(B) (6R,7R)-3-(^a-Cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres

Eine Lösung von 534- mg (0,864 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-cyonostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Ε-Isomeres, in 2 ml T.rifluoressigsäure und 0,5 ml Anisol wurde 5 Minuten bei etwa 23 gehalten, die Lösungsmittel wurden bei 40° (2 nm) eingedampft, 10 ml Äthylacetat wurden zugesetzt und die resultierende Suspension im Vakuum eingedampft.

Der Rückstand wurde mit 25 ml Äther angeriehen, wobei sich 368 mg (94 %) der Säure in Form von gelben Nadeln vom F. 113 bis "29° (Zers.) ergaben.f<! Jp = -58° (c = 1,05, Aceton), λ _v (ÄtOH) 2?4,5 nm (£.16 800) und 347 nm (i 29 300), Inflexion bei 256 nm (<£iO 100); das PMR-Spektrum (DMSO-d_&) zeigte dief -Werte 2,38 und 2,86 (OH=CH, zwei Dubletts, J 16Hz) und 5,90 und 6,PS (C^-H, A3-Qunrtett, J_Aß.18 Hs). R_f 0,41 (System B) und 0,86 (System C).

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(C) (6R,7R)-3-C^-Cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, Z-Isomeres

Eine Lösung von 1,0 g (1,62 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-cyano styryl)-7-(2-thi enylacetamido)-ceph-3-em~4-c arboxylat, Z-Isomeres, in einer Mischung von 4 ml Irifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde zwei Minuten bei etwa 23° gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt. Der Rückstand wurde zwischen 50 ml Ä'thylacetat und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Wasser = 1:1- aufgeteilt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit 2n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH 2 angesäuert und mit Äthylacetat (100 ml, 25 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit 50 ml Wasser und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum verdampft.

Der zurückbleibende Schaum (763 mg) wurde in Ithylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen,, wobei sich 594 mg (81 %) der Säure in Form eines blaßgelben, amorphen Feststoffs vom F. 89 bis 102° (Zers.) ergaben. \*]ψ = -35^° (c = 1,18, Dioxan): A_mw (Ö,1m-pH 6 Phosphatpuffer) 233 nm (£ 18 800) und

111 αΧ · *

320 nm (£ 14 100), Inflexion bei 255 nm (£. 14 000), λ _v (ItOH) 234 nm (£ 17 900) und 322,5 nm (£ 14 400),

Inflexion bei 260 nm (£ 10 400); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) zeigte die ΐ -Werte 3,32 (CH=CH, Singulett), 4,76 (Cz₆^-H, Dublett, J 5 Hz) und 6,40 und 6,82 (C/₂n-H, AB-Quartett, J_AB 18 Hz). R_f 0,41 (System B) und 0,86 (System C).

BeisOiel_6

(A) Diphenylmetbyl-(6R,7R)-7-amino-3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 0,53 ml (7,2 rnMol) Pyridin in ^c< ml trockenem Methylenchlorid wurde während 5 Minuten zu einer gerührten Lösung von 1,5 g (7,2 mMol) Phosphorpentachlorid in 20 ml trockenem Methylenchlorid gefügt. Nach weiterem fünfminütigem

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Rühren wurde die wärme Suspension gekühlt und eine Lösung von 2', 5 g (3,66 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)~ 7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat (Z-Isomeres mit etwa 20 % Ε-Isomerem) in 25 ml Methylenclilorid wurde während 10 Minuten zugetropft, wobei die Temperatur bei etwa 0° gehalten wurde. . ■

Es wurde weitere zwei Stunden gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 23 ansteigen konnte. Die Lösung wurde in eine auf etwa 10° gekühlte Mischung von 15 ml Methanol und 20 ml Methylenchlorid gegossen, die resultierende Lösung 15 Minuten gerührt und mit 50 ml 1n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und 30 Minuten mit gesättigtem Natriumbicarbonat (100 ml) gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 50 ml gesättigtem Natriümbicarbonat und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.

Das zurückbleibende öl wurde in Chloroform gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 1,332 g (65,3 %) des Amins in Form eines orangefarbenen Feststoffes vom F. 1'i7 bis 127° (Zersl) ergaben. \c*\ ^⁰ = -356° (c - 1,11, CHCl₇); > _v (CHCl_x) 286,5 nm (£ 10 800) und 375 nm (£ 12 000):

Πι oJt · y

das PMR-Spektrum (DMSO-d^) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 3'Ό von Z- und Ε-Isomeren war. R- 0,43 (System E), M 5,2 cm.

(B) Dlphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(1-r!aphthoylamino)-ceph-?-pm-^ji-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 1,117 g (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R,73)-7-amino-3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxylat (mit etwa 25 % Ε-Isomerem), Z-Isomeres, in 20 ml trockenem N,N-Dimethylformamid wurde bei 23° gerührt und während 10 Minuten mit einer Lösung von 423 mg (2,2 mMol) 1-Naphthoylchlorid in 10 ml trockenem Acetonitril behandelt. Nach einer Stunde weiterem Rühren wurden die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt, der

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Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 2 χ 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat, 50 ml Wasser und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 1,565 g eines Schaums eingedampft. Dieses Material wurde in 10 ml Benzol gelöst und die Lösung durch Chromatographie an 32 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat = 10:1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit R^-Werten von etwa 0,6 und 0,5 (System D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der zurückbleibende Feststoff (900 mg, 63 °/o) wurde mit 25 ml Äther angerieben, xtfobei sich 725 mg (51 %) des Esters in Form von orangefarbenen Prismen vom F. 124 bis 148° (Zers.) ergaben. £ojψ = -331° (c = 1,12, CHCl₅); A_max (ÄtOH) 281,5 nm (^e 16 600) und 373 nm (£ 15 000); das PMR-Spektrum ("CDCl₇,) zeigte, daß dieses Material eine Mischung (etwa 7-5) von Z- und Ε-Isomeren war. R„ 0,58 und 0,51 (Z- bzw. Ε-Isomere)(System D) und R_f 0,51 (System F).

(C)(6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-(1-naphthoylamino)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres

Eine Lösung von 600 mg (0,84 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-d i η itrostyryl)-7-(1-naphthoylamino)-ceph-3-em-4-c arboxylat, Z-lsomeres (mit etwa 25 % Ε-Isomerem) in einem Gemisch von 2,4 ml Trifluoressigsäure und 0,6 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23° gehalten und "die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt. 20 ml Äthylacetat wurden zugefügt, die erhaltene Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 20 ml Äther angerieben, wobei sich 325 mg (70,5 %) der Säure in Form eines dunklen orangefarbenen Feststoffs vom F. .136 bis 145° (Zers.) ergaben.[o(] ψ = -312° (c = 0,49, Aceton) ;.λ, (ÄtOH) 282 r.m (€15 700) und 390 nm (C 14 200); das PMR-Spektrum (DMS0-d₆) umfaßte 2,72 (CH=CH, Dublett, J 16 Hz), 4,58 (C^n-H, Dublett, J 5 Hz) und 5,91 und 6,21 (C^n-H, AB-Quartett, J.-o 18 Hz). R_f 0,55 (Sysbein B) und 0,78 (System C).

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BAD QFKGINAL

Beißp_iel_7

(A) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-L(Z)-2-hydroxyimino-2-phenylacetamidoJ-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem).

Eine Lösung von 1,117 E (2 mMol) Dipbenylmethyl-(6R,7R)-7-amino--3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit etwa 25 % Ε-Isomerem), hergestellt wie im Beispiel 6(A) und 0,57 ml Propylenoxid in 10 ml trockenem Äthylacetat wurde bei 23° gerührt und während 10 Minuten mit einer 1m-Lösung von (Z)-2-Dichloracetoxyimino-phenylacetylchlorid in Äthylecetat (2 χ 4 ml, etwa 1,2 Äquivalente) behandelt. Nach weiterem 45-minütigem Rühren wurde die Lösung mit 20 ml 2n-Chlorwasserstoffsäure und 20 ml gesättigtem. Ratriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und zu 1,892 g eines Schaumes eingedampft. Dieses Material wurde in 5 ml Benzol gelöst und die Lösung durch Chromatographie an 60 g Kieselgel mi"C Benzol :Äthylacetat = 10:1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit R^-Werten von etwa 0,4 (System D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der zurückbleibende Schaum (999 mg, 70,7 %) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 886 mg (67 %) des Esters in Form eines amorphen, orangefarbenen Feststoii vom F. 114 bis 122° (Zers.) ergaben. ^° (c = 0,96, CHCl,); λ _fl (ÄtOH) 372 nm (C 13 200), Inflexion bei 240 nm (£ 23 600); das PMR-Spektrum (CDCl,) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und Ε-Isomeren war. R_f 0,36 (System D) und 0,12 (System F).

(B) (6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7- f(Z)-2-hydroxyimino-2-phenylacetaniido}-ce-oh-3-em-4-carbonsäure, E-Tsomeres

Eine Lösung von 715 mg (1,01 mMol) des vorstehend unter (A) beschriebenen Esters in 2,88 ml Trifluoressigsäure und 0,72 ml Anisol wurde 4 Minuten bei 23° gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 rnm) entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml Äthylacetat gelöst, die Losung mit 15 ml 2n-Chlorwasserstoffsäure,

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15 ml Wasser und 20 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit 50 ml Äther angerieben und ergab 24-2 mg (44,5 %) der Saure in Form eines dunkelorangefarbenen Feststoffs vom F. 165 bis 173° (Zers.)· [o«J20 ₌ _236,5° (c = 0,9, Dioxan);A, (ItOH) 244 nm (£. 24 700)

■LJ III 9..X. ·

und 389 nm (£14 100); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) umfaßte die T-Werte 2,72 (CH=CH, Dublett, J 16 Hz), 4,64 (C^v-H, Dublett, J 5 Hz) und 5*96, 6,25 (C.^-H, AB-Quartett, J_Aß 18 Hz). R_f 0,54 (System B) und 0,78 (System C). Diese Probe enthielt eine geringe Menge einer sauren Verunreinigung, die als roter Fleck wanderte, R_f etwa 0,10 (System C).

Beisp_iel_8

(A) Diphenylmethyl-(iS,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat —1-oxid, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

Eine Lösung von 610 mg (etwa 3 mMol) meta-Chlorperbenzoesäure in 25 ml trockenem MethylendiChlorid wurde während 5 Minuten zu einer gerührten Lösung von 1,356 g (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat (Z-Isomeres, mit etwa 15 % Ε-Isomerem, hergestellt wie in Beispiel 1(A)(b) beschrieben) in 25 ml Methylendichlorid gefügt. Nach weiterem 15-minütigem Rühren wurde die Lösung mit 2 χ 25 ml gesättigtem Natriumbicarbonat, 2 χ 25 ml Wasser und 25 ml Kochsalzlösung gewaschen und mit etwas Aktivkohle behandelt. Die Suspension wurde durch einen Kieseiguhrpfropfen filtriert, das Filtrat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Feststoff (1,42 g) xvurde mit 25 ml Äther angerieben, wobei sich 1,25 g (89,5 %) des Titeloxids in Form von gelben Prismen vom F. 125 bis 132° (Zers.) ergaben.[<χΈ° ₌ _4₂8° (c = 1,23, CHCl.)jA_mQv (ÄtOH) 276 nm (ε 11 700) und 360 nm (C 12 700), Inflexion bei 235 nm (£ 24 000); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 85:15) der Z- und Ε-Isomeren war. R_f 0,44 (System E).

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(B) (1S,6R_t7R)-5-(2,4~Dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-^-em-4—carbonsäure -1-oxid, E-Isomeres

Eine Lösung von 1,0 g (1,43 mMol) Diphenylmethyl-(iS,6R,7R)-3~ (2,4-dinitro styryl )-7-(2-thienyl ace t amido )-ceph-3-eni-4-carboxylat-1-oxid (Z-Isomeres, mit etwa 15 % Ε-Isomerem) in einer Mischung von 4 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23° gehalten und die Lösungsmittel wurden bei 40 (2 mm) entfernt. 20 ml Ithylacetat wurden zugesetzt, die erhaltene Suspension zur Trockne im "Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 25 ml Äther angerieben, wobei sich 690 mg (90,5 %) der Säure in Form eines gelben Feststoffs vom P. 144 bis 150° (Zers.) ergaben. [<x]^² = -300° (c » 0,94, Aceton); X_v (ÄtOH) 230 nm (£ 24 200), 285 nm (£ 9 700) und 376 nm (C 19 900); das PMR-Spektrum (DMS0-d₆) umfaßte die T-Werte 2,22 und 2,73 (CH=CH, zwei Dubletts,"J 16 Hz), 4,94 (Gz₆N-H, Dublett, J 5 Hz) und 5,56 und 6,33 (C^yK₂, AB-Quartett, J^ 18 Hz). R_f 0,46 (System B) und 0,65 (System C)

Beisp_iel_9

(A) Diphenylrnethyl-(6R,7R)-3-(2,4--dinitrostyryl)-7"forTnamidoceph-3-em-^zt-carboxylat, Z-Isomeres (mit E-Isomerem)

(a) Eine Lösung von 975 mg (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-brommethyl-7-formamidoceph-3-em-^/+-carboxylat und 800 mg (3 mMol) Triphenylphosübin in 30 ml Methylendichlorid wurde drei Stunden in der Dunkelheit bei 23° gerührt und wurde dann während 10 Minuten zu einer heftig gerührten Lösung von 1,177 g (6 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in einer Mischung von 50 ml Methylendir.hlorid und 5^ ml gesättigtem Natriumbicarbor.at:Wasser = 1:1 gefügt. Nach weiterem 30-minütigem Rühren wurde die organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung geloschen, auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 30 g Kieselgel mit etwa 1 1 Methylendichlorid, gefolgt von etwa 1 1 Methylendichlorid: Aceton =1:1 als Eluiermittel, gereinigt. Durch Ver-

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dampfen des letzteren Teiles des Eliiats ergaben sich 1,32 g eines Schaums, der in 5 ml Benzol gelöst wurde. Diese Lösung wurde weiter durch· Chromatographie an 30 g Kieselgel mit Benzol:Äthylacetat = 5:1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit R_f-V/erten von etwa 0,4 (System E) wurden vereint und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Schaum (640 mg, 54-, 5 %) wurde mit 20. ml Äther angerie-ben, wobei sich 485 mg (41 %) des Titelesters in Form eines orangefarbenen, granulären Feststoffs vom F. 118 bis 124° (Zers.) ergaben.£<x] ψ = -350° (c = 0,8, CHCl,); λ (JLtOH) 279 nm (£ 11 700) und 365 nm

\) ΠΙ 3 JL ·

(£ 12 700) [ε -Werte berechnet für C₂₉H₂₂^O₈S (586,6), 1/2 ÄtgOj; das PMR-Spektrum (CDCl₅) zeigte an,, daß dieses Material eine Mischung (etwa 9:1) der Z- und Ε-Isomeren war. R_f 0,40 (System E).

(b) Eine Suspension von 503 mg (1 mMol) Diphenylmethyl-(1S,6R, 7R)-3-brommethyl-7-formamidoceph-3-em-4-carboxylat - 1-oxid, in 25 ml trockenem Methylendichlorid wurde in der Dunkelheit bei 23° gerührt,und eine Lösung von 525 mg (2 mMol) Triphenylphosphin in 5 ml Methylendichlorid wurde zugesetzt. Nach 4-stündigem Rühren wurde die Lösung während 5 Minuten zu einer heftig gerührten Lösung von 589 mg (3 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in einer Mischung von 50 ml Methylendichlorid und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat:Wasser = 1:1 gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt und die organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, auf etwa 50 ml konzentriert und durch Chromatographie an 40 g Kieselgel mit etwa 1 1 Methylendichlorid., gefolgt von etwa 500 ml Methylendichlorid:Aceton = 1:1, als Eluiermittel, gereinigt. Durch Verdampfen des letzteren Teils des Eluiermittel s ergaben sich 880 mg eines Schaums, der in 5 ml Methylendichlorid gelöst wurde, und diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 35 g Kiesel-gel mit Methylendichlorid:Aceton = 8:1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit R„-Werten von etwa 0,4 (Merck-Kieselgel Fp^^,-Dünnschichtchromatographie-Platten, entwickelt mit Methylendichlorid:Aceton = 4:1) wurden

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vereint und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Feststoff (720) mg wurde mit 30 ml Äther angerieben, wobei sich 445 mg (74 %) Diphenylmethyl-('lS,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-formamidoceph-3-em-4-carboxylat - 1-oxid, in Form eines gelben Feststoffs vom F. 115 bis 125° (Zers.) ergaben. [f<]ψ = -383° (c = 0,82, CHCl₅); -X_maXm (ÄtOH) 264,5 nm (£,13 400), 271,5 nm (£ 10 200) und 363 nm (£ 13 100); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und Ε-Isomeren war. Eine Lösung von 302 mg (0,5 mMol) des Oxids in 20 ml trockenem Methylendichlorid wurde bei -20 gerührt und während 5 Minuten mit einer Lösung von 0,12 ml (etwa 2,5 Äquivalente) Phosphortribromid in 5 ml Methylendichlorid behandelt. Die Lösung wurde eine weitere Stunde bei -10 bis -15° gerührt und anschließend während 5 Minuten zu 25 ml gekühltem (0°) gesättigtem Natriurabicarbonat gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 23° ansteigen konnte, und die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung (jeweils 25 ml) gewaschen, mit Aktivkohle behandelt, durch einen Kieseiguhrpfropfen filtriert, getrocknet und unter Bildung von 240 mg eines Feststoffs eingedampft. Eine Lösung dieses Feststoffs in Äthylacetat wurde in Petroläther eingegossen, wobei sich 200 mg (68 %) des Titelesters als gelber, amorpher Feststoff vom F. 90 bis 100° (Zers.) ergaben. L⁰Hl)^{2 =} -²⁷⁸° ^{(c = 0}'95, CHCl₃); a_max_ (ÄtOH) 285 nm (g. 9 800) und 372 nm (t 14 500); das PMR-Spektrum (CDCl₇) zeigte an, daß dieses Mnterin] eine Mischung (etwa 2:1) der Z- und E-Isomeren war. Das IR-Spektrutn und chromatography sehe Charakteristika dieser Probe waren der vorstehend unter (a) beschriebenen ähnlich.

(B) (6R,7R)-3-(2^4-Dinitrostyryl)-7-formnniiidoceph-3-em-4-carbonsäure, E-Inomeres

Eine Lb'rung von ί , 5 g (2,56 mMol) DiphenyImethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl 1-7-form*imidoeeph-3-em-4—carboxyl at _t Z-Tsomeres (mit etwa 15 % E-Isome;von), in einer¹ Mischung von

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6 ml Trifluoressigsäure "und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23 gehalten und die Lösungsmittel wurden bei 40 (2 mm) entfernt. 10 ml Äthylacetat wurden zugefügt, die erhaltene Suspension im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 50 ml Aceton gelöst und mit etwa 1 g Aktivkohle zersetzt. Die Mischung wurde 10 Minuten gerührt und durch einen Kieseiguhrpfropfen filtriert und das Filtrat wurde getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. De · Rückstand wurde mit 50 ml Äther angerieben, wobei sich 854 mg (79,5 %) äer Saure in Form von orangefarbenen Prismen vom F. 163 bis 169° (Zers.) ergaben./VJjf" = -95° (c = 1,14, Aceton); 4 (ÄtOH) 290 nm (£10 400) und 384 nm

ΙΪ13.Χ. ·

(e 18 500), λ (0,1m-pH 6 Phosphatpuffer) 290,5 nm (ε 12 300) und 388 nm (£ 18 800); das PMR-Spektrum (DMSO-dg) umfaßte die T-Werte 2,38 und 2,72 (CH=CH, zwei Dubletts, J 16 Hz), 4,72 (Cz₆N-H, Dublett, J 5 Hz) und 5,92 und 6,26 i^f₂)~^E2' AB-Quartett, J^ 18 Hz). R_f 0,31 (System B) und 0,36 (System C).

Beisp_iel_10

Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, Z-lsomeres (mit E-Isomerem)

Eine Suspension von 391 mg (0,66 Mol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-d initro styryl)-7-formamidoceph-3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres (mit etwa 15 % Ε-Isomerem), in 10 ml Methanol wurde bei 0° gerührt und 0,13 ml (etwa 2 Äquivalente) Phosphoroxychlorid wurden während zwei Minuten zugefügt. Die Mischung wurde weitere drei Stunden gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 23 ansteigen konnte, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. 10 ml Äthylacetat wurden zugesetzt und die erhaltene Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylendichlorid gelöst und die Lösung in Äther eingegossen, wobei sich 351 mg (88,5 °/°) Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-amino-3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxylat - hydrochlorid, in Form eines orangefarbenen Feststoffs vom F. 128 bis 136° (Zers.) ergaben./⁰Jp² = -279°

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(c = 0,95, CHCl_x); λ (ÄtOH) 283,5 nm (r 11 000) und 370 nm (t 14 700); das PMR-Spektrum (DMSO-d_&) zeigte an, daß dieses Material hauptsächlich das Z-Isomere war.

Eine Lösung von 238 mg (0,4 mMol) des Aminhydrochlorids in 20 ml Methylendichlorid wurde 20 Minuten mit 20 ml gesättigtem Natriumbicarbonat gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 10 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und 104 mg (0,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei etwa 23 gerührt und während 5 Minuten mit einer Lösung von 121 mg (0,5 mMol) 2-Thienylessigsäure in 15 ml Methylenchlorid behandelt Nach, weiterem 30-minütigem Rühren wurde der Feststoff abfiltriert und das Filtrat während 30 Minuten mit 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat: Wasser =1:1 gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung (jeweils 25 ml) gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit 20 ml Äthylacetat extrahiert und der Extrakt durch eine Säule mit 20 g Kieselgel mit Äthylacetat als Eluiermittel geleitet. Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft; der feste Rückstand (290 mg) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 216 mg (82,5 %) des Titelesters in Form eines blaßorangefarbenen amorphen Feststoffs vom F. 90 bis 96 (Zers.) ergaben. MS² = -350° (c = 0,89, CHCl_x); λ _v (ÄtOH) 282 mn (£11 400)

JL/ ^ Iu ciX ·

und 372 nm (ε 14 200); das PMR-Spektrum (CDCl_x) zeigte an, daß dieses Material hauptsächlich aus dem Z-Isomeren bestand.

Bei_sp_iel A£ Formulierung der Testreagentien

(a) 50 mg (6R,7R)-3-(E-2,4-Dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit einem Phosphatpuffer, der einen pH von etwa 7,0 ergab, auf 100 ml aufgefüllt.

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(b) Die Lösung von (a) wurde in Scheiben von reinem Cellulosepapier der zur Papierchromatographie geeigneten Art imprägniert, Die Scheiben wurden in einem Ofen bei 50⁰C an der Luft getrock-. net. Stäbchen von reiner Cellulose wurden ebenfalls imprägniert und in der gleichen Weise getrocknet. Die Scheiben und Stäbchen wurden in Exsiccatoren unter Ausschluß von Licht gelagert.

Beispiel_B .

Ein penicillinresxstenter Stamm von Staph. aureus wurde in einer Kulturbrühe 18 Stunden bei 57°C aufgezogen. Anschließend wurde eine ausreichende Menge der Lösung von Beispiel A(a) zugefügt, so daß sich eine Konzentration des Reagens von 100 pg/ml ergab.

Es entwickelte sich rasch eine tiefrote -Farbe, und die spktroskopische Untersuchung,zeigte das Auftreten einer breiten Absorptiohsbande bei 4-85 nm. Gleichzeitig wurde eine Absorptionsbande bei J88 nm in ihrer Intensität herabgemindert.

Die Farbe blieb zumindest 24- Stunden stabil.

Wurde der Test mit einer Lösung des Produkts von Beispiel 5(B), hergestellt wie in Beispiel A(a), so trat eine grüne Färbung auf.

Die grp-ia-n^p-ativen Organismen Enterobacter cloacae P 99 und ihre Hut ante P 99 (H) wurden auf a-far in Petri-Sch alten kultiviert.

Wenn die Kolonien voll entwickelt waren, wurden einige Tropfen der Lasur.?· Λ(?0 auf jeie Platte re-fü'Tt. Die Kolonien von P 99 ergaben ein^p sofortige deutliche rote Farbe, wohin^e^en die Kolonien von P 99-(M) keine Reaktion zeigten. Es ist bekannt,

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BAD

22A9165

daß P 99 ein ß-Lactamase-produzierender Stamm ist, wohingegen dies nicht für P 99 (M) gilt. Die Farbe verblaßte nach 3 Stunden.

Beisp_iel_D

Staph. aureus (penicillinresistent) wurde auf einer Agar-Platte kultiviert. Wenn die Kolonie voll entwickelt wer, wurd'e eine der imprägnierten Scheiben von Beispiel A(b) auf die Kolonien gelegt. Sie nahm rasch eine rote Farbe an.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel

   (D-

   H = CH - Ar

   GO₀H

   worin R eine Aminogruppe oder eine blockierte Aminogruppe ist, Ar eine aromatische Gruppe darstellt;, die mindestens eine elektronenziehende Gruppe in Konjugation mit der exocyclisehen -CH=CH-Doppelbindung trägt, und X die Bedeutung von -S-, -SO-(« oder ß) oder -SOp- hat oder ein Garboxylatderivat davon, als Reagens zum Test von biologischen Proben auf die ß-Lactamaöeaktivität.

   2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

   Ar in Formel I eine aromatische Gruppe ist, die mindestens zwei elektronenziehende Gruppen trägt.

   3. Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Ar 2,4—Dinitrophenyl oder 2,6-Dinitrophenyl ist.

   4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel I oder ein Carboxylatderivat davon verwendet wird, die ein trans-Isomeres ist.

   5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I oder ein Carboxylatderivat davon in Form einer Lösung verwendet wird.

   6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I oder ein Carboxylatderivat davon in in ein weißes oder helles Absorbensmittel

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   imprägnierter Form verwendet wird.
   (7· Verbindungen der allgemeinen Formel

   (I)

   H = CH - Ar

   worin R eine Aminogruppe oder eine blockierte Aminogruppe ist, Ar eine aromatische Gruppe darstellt, die mindestens eine elektronenziehende Gruppe in Konjugation mit der exocyclischen -CH=CH-Doppelbindung trägt, wobei Ar keine 4-Nitrophenylgruppe darstellt, und X die Bedeutung von -S-, -SO- (of oder ß) oder -SOp- hat und deren Garboxylatderivate.

   8. Verbindungen gemäß Anspruch 7," dadurch gekennzeichnet, daß Ar 2,4-Dinitrophenyl ist.

   9· Verbindungen gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie als trans-Isomere vorliegen.

   10. 3-(2,4-Dinitrostyryl)-(6R,7R)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-

   3-em-4-carbonsäure, Ε-Isomeres und die Carboxylatderivate davon.

   11. C2'R,6R,7R)-7-(2'-Amino-2^I-phenylacetamido)-3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carbonsäure-Trifluoressigsäuresalz, Ε-Isomeres und die Carboxylatderivate davon.

   12. (6R,7R)-3-(^-Cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E- und Z-Isomere und die Carboxylatderivate davon,

   13. (6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-(i-naphthoylamino)-ceph-?- em-4-carbonsäure, Ε-Isomeres und die Carboxylatderivate davon.

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   14. (6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-f(Z)-2-hydroxyimino-2-phenylacetamido^-ceph-^-em-^-carbonsäure, Ε-Isomeres und die Carboxylatderivate davon.

   15- (iS,6E,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure -1-oxid, Ε-Isomeres und die Carboxylat derivate davon.

   16. (6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-formamidoceph-3-em-4-carbonsäure, Ε-Isomeres und die Carboxylatderivate davon.

   17· Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch dadurch gekennzeichnet, daß (a) eine Verbindung der Formel

   ;00R

   CH=P(R )

   . Cm)

   worin R und X die in Anspruch 7 angegebenen Bedeutungen besitzen,

   ρ
   R Wasserstoff oder eine Carboxylgruppen-üLockierende Gruppe ist und R^ einen organischen Substituenten darstellt, mit einer Aldehydverbindung der Formel ArCHO, worin Ar wie in Anspruch definiert ist, jedoch keine 4-Nitrophenylgruppe darstellt, umgesetzt wird oder daß man
   (b) eine Verbindung der Formel

   -CHO

   COOR

   (IV)

   worin E, X ui.ri R wie vorstehend untpr ('a) definiert sind, mit einc-m Phot-phoranylid dei¹ Formol

   (Ir)_x = 'MIAr-

   3 0 9 f? 1 7 / 1 1 9 π

   (V)

   224915-5

   worin R* und Ar wie vorstehend in (a) definiert sind, umsetzt und darauf gegebenenfalls (c)

   (i) ein Δ -Isomeres in das gewünschte Δ -Isomere umwandelt;

   (ii) eine Verbindung, worin X die Bedeutung von -SO- besitzt, zu einer Verbindung reduziert, worin X die Bedeutung von -S-besitzt;

   (iii) eine Verbindung, worin X die Bedeutung von -S- besitzt, zu einer Verbindung, worin X die Bedeutung von -SO- oder -SOpbesitzt, oxydiert oder eine Verbindung, worin X die Bedeutung von -SO- hat, zu einer Verbindung oxydiert, worin X die Bedeutung von -SOp hat.

   (iv) eine blockierte Aminogruppe R in eine freie Aminogruppe umwandelt;

   (v) eine Verbindung, worin R eine freie Aminogruppe darstellt, mit einem Reagens umsetzt, das dazu dient, die freie Aminogruppe in eine blockierte Aminogruppe umzuwandeln;

   (vi) die exocyclische -CH=CH-Doppelbindung isomerisiert;

   (vii) eine Carboxylgruppen-blockierende Gruppe von der 4-Carboxylgruppe entfernt und/oder jegliche Gruppen, die Amino- oder Carboxylgruppen schützen, die in einer blockierten Aminogruppe R vorhanden sind, abspaltet; und/oder

   (viii) ein Carboxylatderivat der 4-Carboxylgruppe bildet.

   18. Testmedium zur Verwendung zum Test auf die ß-Lactamaseaktivität, bestehend aus einem weißen oder hellen absorbierenden Mittel, das mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 oder mit einem wasserlöslichen Carboxylatderivat davon imprägniert ist.

   19· Analytisches Reagens zum Test auf die ß-Lactamaseaktivität, bestehend aus einer Lösung einer Verbindung der allgemeinen formel I gemäß Anspruch 1 oder einem Carboxylatderivat davon in einer Konzentration von 10-2000

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